CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)（CloneSelect Single Cell Printer）采用類似噴墨打印的技術(shù)，柔和地產(chǎn)生包裹細(xì)胞的液滴無接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時，該系統(tǒng)借助智能圖像分析，確認(rèn)細(xì)胞數(shù)目，分析細(xì)胞的形態(tài)（大小和圓度）及熒光強(qiáng)度，聯(lián)動的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個細(xì)胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細(xì)胞液滴則分配至微孔板，從而實現(xiàn)對單個細(xì)胞的分選和接種。單細(xì)胞分離系統(tǒng)是一種可比移液器操作的柔和的單細(xì)胞分離技術(shù)，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會降低敏感細(xì)胞和部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞）的成克隆率，因此單細(xì)胞分離系統(tǒng)更適用于基因工程細(xì)胞的克隆，維持細(xì)胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據(jù)。

圖1：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)

近發(fā)表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）開展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個實驗流程起始于轉(zhuǎn)染，接著用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)開展單細(xì)胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平開展分析，后開展細(xì)胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆及分析流程。（圖片來源：文獻(xiàn)1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒中加入了GFP基因，轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選出轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞。系統(tǒng)可設(shè)定細(xì)胞直徑、圓度和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，分選出單個活細(xì)胞并接種至微孔板。圖3為系統(tǒng)分選基因編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞的5張連續(xù)的圖像。通過瀏覽單細(xì)胞分離過程中記錄的5張連續(xù)的圖像，作者統(tǒng)計單細(xì)胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細(xì)胞孔，或空孔或無法確認(rèn)（圖4）。這一結(jié)果表明f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地識別細(xì)胞并成功將其接種至微孔內(nèi)。

圖3：CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選間充質(zhì)干細(xì)胞時采集的5張連續(xù)圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來源：文獻(xiàn)1）。

除了帶GFP的基因敲除質(zhì)粒外，作者還將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照用于評估單細(xì)胞分離效率和克隆率。此外，作者轉(zhuǎn)染了多個不同的基因敲除質(zhì)粒。雖然不同的質(zhì)粒因為大小不同而呈現(xiàn)各異的轉(zhuǎn)染效率，但是成克隆率都達(dá)到了30%。此外，作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（31.3±8%）和未轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細(xì)胞分選過程柔和，因此產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差較?。▓D4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來源：文獻(xiàn)1）。

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平對基因編輯后的間充質(zhì)單細(xì)胞開展分析。后作者選出一株雙等位基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）檢測其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對照開展平行實驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成骨分化培養(yǎng)基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細(xì)胞失去細(xì)長的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，開始呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞樣的形態(tài)，然后在第21天開始出現(xiàn)鈣沉積，發(fā)展過程與親本的MSC對照類似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒有因為基因編輯和篩選過程而受到影響。

圖5：RANKL基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）和親本間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和成骨分化。（圖片來源：文獻(xiàn)1）。

在這個研究中，作者搭建了一整套實驗流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細(xì)胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)各個水平的分析和細(xì)胞功能測試。實驗流程中采用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)成功高效地分選出基因編輯后帶GFP的間充質(zhì)干細(xì)胞。單細(xì)胞接種效率高達(dá)93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達(dá)31.3% (±8%)。相比傳統(tǒng)的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)具有高效率，高活率，操作簡單，單克隆性證據(jù)充分等優(yōu)勢，是基因工程細(xì)胞克隆的理想工具。