簡介

在藥物開發(fā)過程的早期了解其對心臟系統(tǒng)的影響對于提高上市藥物的安全性非常重要。心臟毒性被認(rèn)為是臨床前和臨床試驗(yàn)期間藥物流失的主要原因之一1，2。此外，環(huán)境化學(xué)暴露是心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，但許多環(huán)境因素的毒理學(xué)作用仍未得到充分的檢測3。

人iPSC源性心肌細(xì)胞類似于原代心臟細(xì)胞的表型和功能，并可以避免使用原代細(xì)胞所帶來的變異性。iPSC源性心肌細(xì)胞表現(xiàn)出同步的自發(fā)性收縮，可以被藥物和化合物進(jìn)行修飾，使其成為生物學(xué)相關(guān)模型。雖然可以在透射光下記錄機(jī)械性收縮，但也有研究表明，使用Ca2+ 敏感熒光染料觀察到的鈣振蕩模式紊亂可用于測量對心肌細(xì)胞搏動率和模式的影響5，6。之前的應(yīng)用文章中描述了使用ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)在iPSC 源性心肌細(xì)胞中進(jìn)行延時成像，記錄和分析鈣振蕩的方法4-6。

這篇應(yīng)用文章展示了MetaXpress分析工具用于觀察和分析2D和3D心肌細(xì)胞樣品中Ca2+振蕩信號軌跡的實(shí)用性。我們描述了熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的生成，突出了在iPSC源性心肌細(xì)胞球上運(yùn)行的目標(biāo)物強(qiáng)度通量分析。此外，我們總結(jié)了生成多參數(shù)峰值讀數(shù)的步驟，包括拍攝頻率、峰值寬度、振幅和規(guī)律性。

Materials

•       iCell心肌細(xì)胞2 （FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.）

•       iCell心肌細(xì)胞平板培養(yǎng)基 （FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.）

•       iCell心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基（FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.）

•       384孔微孔板（Corning,cat. # 3712）

•       384 孔、低吸附、U型微孔板（Corning,cat. #3830）

•       0.1% 明膠（Sigma, St. Louis, MO）

•       EarlyTox心臟毒性試劑盒或鈣6染料 （Molecular Devices）

•       采用ImageXpress Micro Confocal共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和6.5版本MetaXpress®圖像采集分析軟件（Molecular Devices）

優(yōu)勢

•       記錄2D和3D心肌細(xì)胞樣品中的Ca2+振蕩

• 分析復(fù)雜的動力學(xué)模式

• 測量熒光隨時間推移的波動

• 生成多參數(shù)峰值數(shù)據(jù)

• 在高密度微孔板中篩選化合物對心臟功能的復(fù)合效應(yīng)

方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，以2D或3D檢測形式培養(yǎng)人iPSC源性心肌細(xì)胞。對于傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)，將細(xì)胞以7，000 個細(xì)胞/孔接種到384孔微孔板的明膠包被中。對于3D培養(yǎng)形式，將5，000個細(xì)胞在明膠的存在下接種到低附著U形384孔微孔板中。接種后4至5天，用已知有心臟活性和心臟毒性的化合物處理心肌細(xì)胞，濃度范圍為100µM-0.3 µM，持續(xù)1小時、24小時和5天6。然后使用EarlyTox心毒性檢測試劑盒或鈣6染料對心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，這兩種試劑盒均可檢測心肌細(xì)胞收縮的動力學(xué)指標(biāo)——細(xì)胞質(zhì)中鈣水平的變化。將延時成像程序設(shè)置為3-10 ms的曝光時間、0.1-0.3秒的時間間隔、60-100個總時間點(diǎn)，在一個孔中采集整個時間序列，然后采集下一個孔6。此快速動力學(xué)成像在ImageXpress Micro Confocal細(xì)胞成像系統(tǒng)中以寬場模式進(jìn)行采集（10X物鏡、FITC通道）。

MetaXpress軟件中的Journal可用于自動化自定義圖像采集、圖像處理和圖像分析工作流程。
使用Journal（Object Intensity Flux）只需點(diǎn)擊一次即可運(yùn)行和分析各種細(xì)胞和檢測類型的振蕩行為，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物并對其進(jìn)行熒光強(qiáng)度振蕩分析。圖 1B 顯示了該分析的心球圖像。該方法可以測量圖像熒光或明場強(qiáng)度隨時間推移的重新分布。圖1B顯示了心肌細(xì)胞的分析圖像。選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)化選項(xiàng)后，可用此方法對透射光下捕獲的心肌細(xì)胞的無標(biāo)記記錄以及熒光樣本記錄進(jìn)行分析。圖1B顯示了2D心肌細(xì)胞圖像的強(qiáng)度變化分析。熒光強(qiáng)度和閾值百分比數(shù)據(jù)被繪制成圖表并用于下游Ca2+振蕩（表示心跳）的多參數(shù)計(jì)算（圖2和3）6。

圖 1：細(xì)胞球和2D心肌細(xì)胞Ca2+振蕩圖的示意圖。 使用鈣6染料染色的細(xì)胞球和2DiPSC 源性心肌細(xì)胞的延時圖像。（A）目標(biāo)物強(qiáng)度通量分析利用最大熒光強(qiáng)度的圖像來創(chuàng)建分割掩膜。該分割應(yīng)用于給定細(xì)胞球的整個時間點(diǎn)圖像集合，以測量熒光強(qiáng)度隨時間的變化。（B）強(qiáng)度變化分析可測量熒光信號隨時間的重新分布，并生成百分比閾值和平均熒光強(qiáng)度測量值。

圖像分析

測定2D 和3D心肌細(xì)胞樣品單平面圖像
細(xì)胞隨時間推移的熒光強(qiáng)度波動以分析心臟細(xì)胞搏動

本應(yīng)用手冊中，我們在ImageXpress Micro Confocal系統(tǒng)中以0.2 秒的時間間隔對iPSC源性心肌細(xì)胞的細(xì)胞球進(jìn)行共60 個時間點(diǎn)的成像，并使用MetaXpress軟件中的Object IntensityFlux進(jìn)行分析。該分析可以從時間點(diǎn)圖像集合中識別最大強(qiáng)度的細(xì)胞球圖像，并使用該閾值來分割細(xì)胞球。該分割應(yīng)用于給定孔的整個時間點(diǎn)圖像集合，以測量平均熒光強(qiáng)度（圖 1）。

數(shù)據(jù)分析

使用峰值分析軌跡生成多個參數(shù)

通過繪制平均熒光強(qiáng)度與MetaXpress軟件中時間的曲線，以觀察化合物處理后細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 的表型反應(yīng)。圖2展示的振蕩強(qiáng)度圖可以被用于優(yōu)化峰值分析設(shè)置（圖 3A），以最佳方式表示軌跡。如果細(xì)胞熒光強(qiáng)度存在孔間變化，可以針對不同孔中峰值之間的振幅和斜率閾值變化，選擇動態(tài)閾值功能進(jìn)行調(diào)整（圖 3A）。確保為所有孔準(zhǔn)確找到峰值。SmoothWidth值是指用于平滑峰值數(shù)據(jù)的點(diǎn)數(shù)，應(yīng)足夠高，以平滑峰值檢測的噪聲。過高的值最終將出現(xiàn)在未計(jì)數(shù)的實(shí)際峰值中，而過低的值則可能將噪聲峰值視為峰值。

圖 2. 心臟毒性化合物的代表性鈣流信號軌跡（平均熒光強(qiáng)度）。 所示跡線是典型的表型反應(yīng)，包括未受影響的常規(guī)Ca2+通量（DMSO對照）模式，以及受影響的阿司咪唑、舒尼替尼、利培多、西沙必利等模式。這些跡線代表處理24小時后心肌細(xì)胞球的反應(yīng)。

MetaXpress峰分析工具生成的測量值可以輕松導(dǎo)出為表格或文本文件。測量結(jié)果包括搏動率、峰值振幅、峰值寬度、上升和衰減時間以及規(guī)律性，可深入觀察化合物處理后心臟搏動率和模式的變化（圖 3B）。

圖 3. 使用MetaXpress峰值分析法分析鈣流信號軌跡（平均熒光強(qiáng)度）。（A）用戶界面設(shè)置和計(jì)算讀數(shù)的截圖。設(shè)置平滑寬度和擬合寬度，以最好地顯示心臟搏動圖中的軌跡。（B）與峰相關(guān)的峰分析測量值。

結(jié)論

MetaXpress軟件6.5版本及更高版本具備記錄和分析復(fù)雜動力學(xué)模式包括代表細(xì)胞收縮的鈣振蕩的能力。使用ImageXpress Micro系統(tǒng)對2D 和3D心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的Ca2+ 振蕩進(jìn)行快速動力學(xué)熒光成像，并使用MetaXpress峰分析工具進(jìn)行分析，能夠?qū)Ω呙芏任⒖装逯械男呐K功能進(jìn)行化合物篩選和研究。該一體化軟件可無縫結(jié)合成像、分析、生成圖表和數(shù)據(jù)，從而提供未經(jīng)處理和已處理樣品中心臟搏動特征的完整視圖，以便對候選藥物進(jìn)行早期鑒定或評估由環(huán)境因素引起的心臟毒性作用。

參考文獻(xiàn)

1.       Berridge BR, Hoffmann P, Turk JR, Sellke F, Gintant G, Hirkaler G, Dreher K, Schultze AE, Walker D, Edmunds N, Halpern W, Falls J, Sanders M, Pettit SD. Integrated and translational nonclinical in vivo cardiovascular risk assessment: Gaps and opportunities. Regul Toxicol Pharmacol. 2013;65:38–46. Web.

2.       Laverty H, Benson C, Cartwright E, Cross M, Garland C, Hammond T, Holloway C, McMahon N, Milligan J, Park B, Pirmohamed M, Pollard C, Radford J, Roome N, Sager P, Singh S, Suter T, Suter W, Trafford A, Volders P, Wallis R, Weaver R, York M, Valentin J. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 2011;163:675–693. Web.

3.       Judson R, Richard A, Dix DJ, Houck K, Martin M, Kavlock R, Dellarco V, Henry T, Holderman T, Sayre P, Tan S, Carpenter T, Smith E. The toxicity data landscape for environmental chemicals. Environ Health Perspect. 2009;117:685–695. Web.

4.       Sirenko O, Crittenden C, Callamaras N, Hesley J, Chen YW, Funes C, Rusyn I, Anson B, Cromwell EF. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using ipsc cells. J Biomol Screen. 2013a;18:39–53. Web.

5.       Sirenko O, Cromwell EF, Crittenden C, Wignall JA, Wright FA, Rusyn I. Assessment of beating parameters in human induced pluripotent stem cells enables quantitative in vitro screening for cardiotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2013b;273:500–507. Web.

6.       Sirenko O, Hancock MK, Crittenden C, Hammer M, Keating S, Carlson CB, Chandy G. “Phenotypic Assays for Characterizing Compound Effects on Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids." Assay Drug Dev Technol. 2017 Aug/Sep;15(6):280-296. Web.