美谷分子儀器(上海)有限公司

DOWNLOAD

當(dāng)前位置:首頁(yè)   >>   資料下載   >>   3D 成像表征生物打印的卵巢癌模型

3D 成像表征生物打印的卵巢癌模型

時(shí)間:2023-3-17 閱讀:814
分享:
  • 提供商

    美谷分子儀器(上海)有限公司
  • 資料大小

    990.9KB
  • 資料圖片

    查看
  • 下載次數(shù)

    0次
  • 資料類型

    PDF 文件
  • 瀏覽次數(shù)

    814次
點(diǎn)擊免費(fèi)下載該資料

簡(jiǎn)介
3D 生物打印被定義為細(xì)胞和生物相容性材料功能性 3D 結(jié)構(gòu)或人工組織模型。1 這項(xiàng)技術(shù)改變了組織工程領(lǐng)域,使得創(chuàng)建復(fù)雜的預(yù)定義設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)成為可能,同時(shí)確??芍貜?fù)性。幾種基于 3D 生物打印的方法已報(bào)告用于工程化各種組織,如軟骨、2 骨、3 以及皮膚再生。4 該技術(shù)也被用于創(chuàng)造新的臨床前腫瘤模型。事實(shí)上,作為 2D 細(xì)胞培養(yǎng)模型由于缺乏預(yù)測(cè)性而受到越來越多的質(zhì)疑, 3D 生物打印已成為一種替代方法通過處理不同的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)衍生分子,腫瘤微環(huán)境的建模 / 展示 (TME) 來規(guī)避這個(gè)問題。許多基于 3D 生物打印的腫瘤模型包括肺癌、5 乳腺癌和 6 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。7 這些模型在設(shè)計(jì)方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì),與其他策略相比具有靈活性和可重復(fù)性如 細(xì)胞球和類器官。 卵巢癌是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題,3D 生物打印仍作為 卵巢癌模型仍在研究中。在此類腫瘤類型中,顯示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 與癌細(xì)胞發(fā)生密切相互作用,在癌癥侵襲和耐藥中發(fā)揮主要作用。8,9 因此 CAFs 是設(shè)計(jì)卵巢癌模型的關(guān)鍵。
優(yōu)勢(shì)
高內(nèi)涵篩選和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有助于表征和驗(yàn)證 3D 生物打印實(shí)驗(yàn) • 瞬時(shí)基因表達(dá)是增加 3D 生物打印模型的多功能性的有力工具 • 多波長(zhǎng)分析工具對(duì)于充分利用 3D 生物打印模型的強(qiáng)大功能進(jìn)行研究不同細(xì)胞類型群體在模型內(nèi)的相互作用是必需的在此應(yīng) 用說 明 中,3D 生物打印用于創(chuàng)建包含癌細(xì)胞 ( SKOV3 細(xì)胞 ) 和 CAF 成纖維細(xì)胞 ( MeWo 細(xì)胞 ) 的卵巢癌模型。使用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞和并用 CellTracker 和 Orange CMRA Dye (ThermoFisher) 將 MeWo 細(xì)胞染色。兩種細(xì)胞類型均包含在明膠 - 藻酸鹽 - 基于水凝膠以獲得用于形成圓柱形腫瘤樣結(jié)構(gòu)。模型的均相性以及這些腫瘤內(nèi)細(xì)胞分布的可重復(fù)性,使用 ImageXpress Pico 進(jìn)行評(píng)估成像系統(tǒng)。
結(jié)果和討論
如圖 1 所示,生物打印結(jié)構(gòu)成像顯示表達(dá) GFP 的 SKOV3 細(xì)胞和熒光染色的 MeWo 細(xì)胞均質(zhì)分布于明膠 - 藻酸鹽 基體 ( 圖 1A 和 B )。這非常重要,因?yàn)橥|(zhì)細(xì)胞分布均勻分布在生物墨水中是 3D 打印過程中需要考慮的重要因素 12 此外,天然 TME 是已知包含多種緊密相互作用的細(xì)胞類型。13 因此,重現(xiàn)這一點(diǎn)至關(guān)重要,同時(shí)構(gòu)建體外腫瘤模型以促進(jìn)癌癥和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。
而腫瘤中應(yīng)結(jié)合多種細(xì)胞類型以更好地模擬 TME 異質(zhì) 性,每種細(xì)胞類型的數(shù)量及其比例需要加以控制以確??芍貜?fù)性。ImageXpress Pico 是一個(gè)特別適合用于實(shí)現(xiàn)此類控制,因其可以快速輕松地捕獲多張顯微鏡圖像。 軟件 CellReporterXpress 允許對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量即使是厚樣品,也可使用 Z-stack 的最大投影實(shí)現(xiàn)。在此應(yīng)用說明中,此系統(tǒng)用于分析我們的生物打印腫瘤模型在細(xì)胞數(shù)量和比例方面顯示出良好的可重復(fù)性在 6 個(gè)生物打 印的結(jié)構(gòu),SKOV3 細(xì)胞的平均數(shù)量 ( 細(xì)胞計(jì)數(shù) FITC ) 為 837 ± 200 ( 標(biāo)準(zhǔn)差 ≤ 25% )。對(duì)于 MeWo 細(xì)胞 ( 細(xì)胞計(jì) 數(shù) TRITC ),平均數(shù)量為 3264.50 ± 462 (StD ≤ 15%)。


圖 1 分析含有轉(zhuǎn)染 GFP 質(zhì)粒的 SKOV3 細(xì)胞和經(jīng) CellTracker Orange 染色的 MeWO 細(xì)胞的 3D 生物打印結(jié)構(gòu) CMRA 染料。A) 使用 ImageXpress Pico 系統(tǒng) (4X,Z-stack) 采集的孔 B3 中 3D 生物打印結(jié)構(gòu)的 FITC 和 TRITC 圖像。B) 分析使用 CellReporterXpress 軟件創(chuàng)建的 FITC 和 TRITC 細(xì)胞計(jì)數(shù)的 掩膜。C) 樣品的 FITC 和 TRITC 通道中的平均細(xì)胞數(shù)量 (5 孔,染色和轉(zhuǎn)染 ) 和陰性對(duì)照 (3 孔,未染色和未轉(zhuǎn)染 )。D) 轉(zhuǎn)染效率的評(píng)估,使用 GFP 質(zhì) 粒和 jetOPTIMUS-Polyplus-transfection-transfection 試劑盒 (FITC 陽(yáng)性細(xì)胞百分比 /TRITC 陽(yáng)性細(xì)胞 )。
本應(yīng)用說明展示了可視化可在生物打印中快速觀察到特定基因結(jié)構(gòu)??蓪?shí)現(xiàn)瞬時(shí)基因表達(dá),生物打印結(jié)構(gòu)的特定細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染后再通過生物打印構(gòu)建將其整合到 3D 中。這是 3D 生物打印相較于其他 3D 培養(yǎng)方法的一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì),例如已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞球和類器官的培養(yǎng)具有挑戰(zhàn)性。 在這個(gè)初步實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染效率估計(jì)為 25% (StD 3.48%) ( 圖 1D )。還可以進(jìn)一步優(yōu)化,例如,通過使用 ImageXpress Pico 可篩選多個(gè)濃度轉(zhuǎn)染混合物、DNA 質(zhì)粒量和時(shí)間。該方法還提供了進(jìn)行基因檢測(cè)的可能性,基質(zhì)和癌癥中的沉默和 / 或基因編輯細(xì)胞。 總之,我們將轉(zhuǎn)染、熒光成像和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合以表征和驗(yàn) 證 3D 含癌細(xì)胞和 CAF 的生物打印卵巢腫瘤模型。我們可以證明兩種細(xì)胞類型及其基質(zhì)中的接近度,有利于細(xì)胞互動(dòng)。這種方法為提供了創(chuàng)建具有受控且可重復(fù)的細(xì)胞分布的更復(fù)雜和完整的腫瘤模型的可能性,且沒有在 3D 模型中觀察到的染料滲透的局限性。因此,3D 生物打印腫瘤模型可以快速在整合到微流控系統(tǒng)。然后可以長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)在生理流下創(chuàng)造更多體內(nèi)樣抗癌藥物開發(fā)的臨床前模型。

材料和方法
水凝膠制備
對(duì)于水凝膠制備,所需質(zhì)量的對(duì)明膠和海藻酸鈉粉末進(jìn)行稱重,在紫外線下 1 小時(shí),然后溶解在 Dulbecco 改 良 EagleMedium 中混合lowest必需培養(yǎng)基 (MEM),補(bǔ)充有 10% 胎牛血清。所得溶液為然后在磁力攪拌下在 37℃ 下 保持過夜,complete均質(zhì)化。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和染色根據(jù)制造商的說明,使 用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞。10 簡(jiǎn)言之,適量的 DNA 稀釋至 jetOPTIMUS 緩沖液并適當(dāng)?shù)募尤?jetOPTIMUS 轉(zhuǎn)染試 劑。轉(zhuǎn)染溶液在室溫下保存 10 分鐘,然后添加到培養(yǎng)的 SKOV3 細(xì)胞中,以 60–80% 融合度培養(yǎng)在 T75 燒瓶中。 使 用 CellTracker Orange CMRA 染 料 (ThermoFisher) 對(duì) MeWO 細(xì)胞進(jìn)行染色,按照制造商的說明。11 簡(jiǎn)言 之,將染料溶解在 DMSO 中制備工作溶液,然后稀釋在 MEM 培養(yǎng)基中。將細(xì)胞在 37℃ 孵育 30 分鐘。 然后取出試劑溶液,替換為新鮮的complete培養(yǎng)基。


圖 2 用于對(duì)卵巢癌模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物打印和成像的方法示意圖。

  

細(xì)胞包封
對(duì)于生物墨水制備,胰蛋白酶消化的細(xì)胞重懸于新鮮培 養(yǎng)基中并小心添加之前制備的聚合物溶液。獲得的緩慢攪拌懸浮液以使細(xì)胞均質(zhì)化的分布在生物墨水中。
生物打印工藝

將制備好的生物墨水裝入 3 mL 濾芯中并裝入生物打印 頭。生物打印在 24 孔板中進(jìn)行。每個(gè) 3 毫升濾芯生物打 大約 48 種結(jié)構(gòu)。生物打印后,使用 100 mM CaCl2 溶液 交聯(lián)結(jié)構(gòu),補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基并在 37℃ 和 5% CO2 條件下 培養(yǎng),直至實(shí)驗(yàn)。 

細(xì)胞成像

將生物打印結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到 96 孔板中 ( Greiner 655892,玻 璃底,黑壁 )。 使用 ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng),使用 4X 物 鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。 通過透射光、FITC 和 TRITC 通 道 分 別以 5、150 和 250 ms 曝光時(shí)間在每個(gè)孔采集圖像。4X 物鏡顯示約占孔總 面積的 40%。采用基于硬件和基于圖像的自動(dòng)對(duì)焦相結(jié) 合的方法,獲 得了距離為 50 μm 的 7 個(gè) Z 平面 (Z 層疊 加 )。最大二維投影圖像是實(shí)時(shí)生成的。 Cell ReporterXpress 軟件中預(yù)先配置的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析模 塊用于在 FITC 或 TRITC 通道中使用信號(hào)量化細(xì)胞。用 于分析的分割參數(shù)為強(qiáng)度、最小值和最大寬度。FITC 通 道的值為 23,7,100,TRITC 通道為 23,7,38。 


會(huì)員登錄

×

請(qǐng)輸入賬號(hào)

請(qǐng)輸入密碼

=

請(qǐng)輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標(biāo)簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時(shí)間回復(fù)您~
撥打電話 產(chǎn)品分類
在線留言