吡咯啉5羧酸合成酶(P5CS)測(cè)試盒微量法

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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

商品屬性：

測(cè)定意義：

吡咯啉-5-羧酸還原酶( P5CRs) 是普遍存在于原核和真核生物中的一類重要的管家蛋白。其主要功能是催化氨酸生物合成的最后一步反應(yīng)，將吡咯啉-5-羧酸( P5C) 轉(zhuǎn)化為氨酸，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等一系列病理和生理過程中起著重要作用。
測(cè)定原理：
P5CR具有噻唑烷-4-羧酸脫氫酶活性，催化噻唑烷-4-羧酸的脫氫反應(yīng)，同時(shí)將NAD轉(zhuǎn)化為NADH，測(cè)定340nm下吸光值增加速率來反映酶的活性。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液一：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 14μL×1 支，4℃保存；

組織樣本的前處理：

①總 GAPDH 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中 GAPDH 酶活性。

建議測(cè)定總 GAPDH 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在試劑三中加入 500μL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（3）在 1mL 石英比色皿中加入 30μL 樣本、20μL 試劑三和 950μL 工作液，混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值

A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。GAPDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.144×ΔAV 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

生化檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明：

一、抗氧化系列生化檢測(cè)試劑盒

包括氧化酶（XO）活性分析、超氧陰離子清除能力分析、葡萄糖氧化酶活性（GOD）檢測(cè)、總抗氧化能力（TAC）檢測(cè)、植物原花青素(OPC)含量檢測(cè)、植物類黃酮含量檢測(cè)、植物總酚（TP）含量檢測(cè)試劑盒。

氧化酶（XO）活性分析試劑盒為例，提供了一種簡單易用的比色分析法，用于測(cè)定各種樣品中的XO活性，特點(diǎn)是測(cè)定血清，血漿，組織/細(xì)胞裂解物和其他生物體液中的氧化酶活性，以及廣泛的檢測(cè)范圍：15.6 -500 mU/mL。

二、氧化系列生化檢測(cè)試劑盒

包括過氧化氫酶 (CAT) 活性分析、過氧化氫（H2O2）檢測(cè)、脂質(zhì)過氧化(丙二醛) 分析、蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)、超氧陰離子含量檢測(cè)等試劑盒。

蛋白質(zhì)羰基含量檢測(cè)試劑盒（比色法）為例，提供了一種簡單易用的比色法，用于分析不同生物樣品（細(xì)胞/組織裂解液，生物液體）中蛋白質(zhì)羰基含量。在370 nm處有特征吸收峰。

特點(diǎn)是：1.測(cè)定組織樣本、細(xì)胞、細(xì)菌、血清等中的蛋白質(zhì)羰基含量。2.樣本處理、實(shí)驗(yàn)步驟以及結(jié)果計(jì)算更加詳盡準(zhǔn)確精煉。3.保質(zhì)期長。

三、抗逆系列生化檢測(cè)試劑盒

包括超氧化物歧化酶 (SOD) 活力檢測(cè)、羥自由基清除能力分析、多酚氧化酶（PPO）活性檢測(cè)、過氧化物酶(POD)活性檢測(cè)等試劑盒。

超氧化物歧化酶 (SOD) 活力檢測(cè)試劑盒為例，提供一種簡單易用的比色測(cè)定法，用于定量測(cè)定血清，血漿，組織/細(xì)胞裂解液和其它生物體液中的SOD酶活性。

特點(diǎn)是：1.測(cè)定血清，血漿，組織/細(xì)胞裂解物和其他生物體液中的SOD酶活性。2.通過WST-8法測(cè)定SOD活性，zui大抑制率可接近100％，不受一些常見干擾因素的干擾。3.廣泛的檢測(cè)范圍：3.13- 200U/mL。

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