豬肝星狀細胞永生化細胞專用培養(yǎng)基凍存 

1）離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中；

2）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；

3）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。續(xù)寫內(nèi)容如下：

為確保細胞凍存后的存活率和功能穩(wěn)定性，后續(xù)還需進行復蘇驗證。具體步驟如下：

1. **復蘇準備**：從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中輕柔搖晃，使細胞懸液在1-2分鐘內(nèi)融化。注意避免長時間高溫暴露，以防細胞損傷。

2. **離心洗滌**：將融化的細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，緩慢加入5mL預熱的培養(yǎng)基以稀釋凍存液。隨后以300×g離心5分鐘，棄上清以去除殘留的凍存保護劑。

3. **重懸接種**：用適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，輕柔吹打均勻后接種至預處理好的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24小時后觀察細胞貼壁情況，更換新鮮培養(yǎng)基以去除未存活細胞碎片。

4. **質(zhì)量評估**：復蘇后48小時，通過臺盼藍染色計數(shù)活細胞比例，同時可進行免疫熒光染色（如GFAP、α-SMA）或功能實驗（如吞噬檢測）以確認星狀細胞的表型和活性。若活率低于80%，需優(yōu)化凍存程序或調(diào)整凍存液配方。

**注意事項**：

- 全程操作需無菌，避免反復凍融；

- 液氮儲存時確保凍存管密封性，防止爆炸風險；

- 長期保存需定期檢查液氮罐液位，避免細胞失活。

通過上述標準化流程，可最大限度保留豬肝星狀細胞的永生化特性，為后續(xù)肝纖維化研究或藥物篩選提供穩(wěn)定細胞資源。