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影響人正常組織來源細胞轉(zhuǎn)染效率因素有哪些?

閱讀:234          發(fā)布時間:2018-4-4

影響人正常組織來源細胞轉(zhuǎn)染效率因素主要有三個,細胞種類(狀態(tài))、質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)染試劑。為了得到一個好的轉(zhuǎn)染結(jié)果,我們要像下面這樣做。
轉(zhuǎn)染前
1、轉(zhuǎn)染前細胞的狀態(tài)和密度都非常影響轉(zhuǎn)染效率和后期的實驗結(jié)果。轉(zhuǎn)染時細胞的密度為50%-80%較好,同時注意在轉(zhuǎn)染后收細胞時的密度不要過高。
比如轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到細胞內(nèi),48小時后做WB,那么此時細胞的密度不要長滿. 因為細胞長的過高嚴(yán)重影響細胞的狀態(tài)(周期進程阻滯,凋亡增加等)從而影響實驗結(jié)果。一般為前一天下午鋪板,第二天上午進行轉(zhuǎn)染,48小時后收細胞進行功能檢測。
2、不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體*搭配比例不同,轉(zhuǎn)染前,應(yīng)該摸一個*配比??梢园凑召|(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5的梯度比例來檢測*轉(zhuǎn)染比例。
3、支原體污染會嚴(yán)重影響細胞轉(zhuǎn)染的效率,且支原體污染不會像細菌污染那么明顯可見,轉(zhuǎn)染前可以用環(huán)丙沙星殺一殺支原體。
轉(zhuǎn)染時
轉(zhuǎn)染時
1、轉(zhuǎn)染時,要小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻(說明書上的用詞為:Mix gently),避免粗暴用力吹打,會導(dǎo)致脂質(zhì)體失效。

2、轉(zhuǎn)染時各種培養(yǎng)皿添加的質(zhì)粒和脂質(zhì)體參考量對查看相對應(yīng)的表!
轉(zhuǎn)染后
1、現(xiàn)在大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑可以使用帶血清的培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后6小時更換培養(yǎng)基,一是lipo2000具有一定毒性,二是培養(yǎng)基需要更換成有血清培養(yǎng)基。
2、轉(zhuǎn)染后效率的檢測:
(1)觀察轉(zhuǎn)染后細胞熒光情況
(2)qPCR驗證。
(3)WB檢測敲減或者過表達蛋白。
3、人正常組織來源細胞轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高,可以通過兩種方法:
(1)復(fù)轉(zhuǎn)染,即轉(zhuǎn)染后12-24小時再次進行轉(zhuǎn)染,前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好,轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少。
(2)通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。
Lumefantrine     苯芴醇標(biāo)準(zhǔn)品    82186-77-4     100mg
Bismuth Citrate    枸櫞酸鉍標(biāo)準(zhǔn)品    813-93-4    100mg
Clarithromycin    克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品    81103-11-9    100mg
Fluticasone Propionate     氟替卡松丙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品    80474-14-2     100mg
Sertraline Hydrochloride     鹽酸舍曲林標(biāo)準(zhǔn)品    79559-97-0     100mg
Mebrofenin    甲溴菲寧標(biāo)準(zhǔn)品    78266-06-5     100mg
    碘海醇相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品    76820-34-3     100mg
Terfenadine Related Compound A    特非那定相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品    76815-60-6     100mg
Docusate Potassium    " 
1,2-二(2-乙基己基氧碳基)乙烷磺酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品 7491-09-0    100mg
人正常組織來源細胞

 

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