化工儀器網(wǎng)
詳細介紹
以下是細胞生物學試劑的詳細介紹：
| 中文名稱 | 英文名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 發(fā)貨周期 |
| MTT檢測試劑盒 | MTT Assay Kit | 500次 | 1～3天 |
商品介紹：
| MTT廣泛用于檢測細胞生長，其原理是MTT可以被活細胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結(jié)晶，而死細胞則無此活性。深紫色的formazan結(jié)晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細胞的活力，細胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。 產(chǎn)品特點： 1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。 2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復性好。 3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個96孔細胞培養(yǎng)板)微孔板檢測。 4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等 儲存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。 使用方法： 下面操作是檢測細胞毒性的試驗，其他應用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。 ㈠、接種細胞 1．按常規(guī)胰酶消化法消化匯合的單層細胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。 2．200g離心5分鐘收集細胞沉淀。 3．用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，制備成單細胞懸浮液并計數(shù)。 4．將細胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據(jù)細胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個/mL。 5．將足夠量的細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細胞懸液。 6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細胞懸液(對正常細胞)。如果是腫瘤細胞，則加入100μL腫瘤細胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細胞加在孔的正中，否則細胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。 7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照(用于測OD時調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應對第11 列反應的影響。 8．按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細胞進入指數(shù)生長期。 ㈡、藥物處理 9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。 10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動細胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。 11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細胞-藥物的對照。 12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。 13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細胞的時間，由用戶自己決定。 14．處理結(jié)束后去除第2 到第11列(共10列，均含細胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。 15．每天換培養(yǎng)使細胞數(shù)量擴增2-3倍(所需時間隨細胞不同而不同)。 ㈢、存活細胞計數(shù) 16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時。注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。 17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會影響光吸收，最好盡可能去除。 18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。 19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。 ?注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照)調(diào)零。 20．計數(shù)同樣處理的各次重復的平均值。 21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進作用的則斜率加大。 |
細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
操作步驟：
1. 樣品染色
1) 將Binding Buffer（10×）稀釋成1×Binding buffer工作液備用（1ml Binding Buffer（10×）需加入9ml無菌去離子水）。
2) 對于懸浮細胞，500-1000g離心5min收集細胞。
對于貼壁細胞，要用不含EDTA的胰酶消化細胞，胰酶消化時間不宜過長或過短，最好是在輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，加入細胞培養(yǎng)液，將細胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，500-1000g離心5min收集細胞。
3) 收集細胞后，加入預冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌，離心收集細胞，共洗滌兩次。
4) 在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細胞，使細胞濃度達到1×106 cell/ml。
5) 吸取100μl細胞懸液（細胞總數(shù)為1×105 cell）至一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。
2. 樣品檢測
1) 流式細胞儀檢測：
染色孵育后，每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液，混勻后使用流式細胞儀檢測（1小時內(nèi)檢測）。
建議設(shè)置經(jīng)凋亡誘導的正常細胞、PI單染和Annexin V-FITC單染3個對照組，正常細胞組可作為熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。結(jié)果可用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC為橫坐標，PI為縱坐標。Annexin V-FITC和PI聯(lián)合使用時，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色雙重熒光。
2) 熒光顯微鏡檢測：
染色孵育后涂片，顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細胞膜完整性的細胞，細胞核顯示紅色，膜上有綠色光環(huán)。
Micrococcal Nuclease 8000 units
Exonuclease III 4000 units
RNase H 100 units
RNase H 500 units
S1 Nuclease 10000 units
Uracil-DNA Glycosylase 200 units
Uracil-DNA Glycosylase 5x200 units
DNase I, RNase-free 1000 units
DNase I, RNase-free, HC 1000 units
DNase I, RNase-free (supplied with MnCl2) 1000 units
RNase A, DNase and protease-free 10 mg
RNase T1 100000 units
RNase T1 500000 units
RNase A/T1 Mix 1 ml
Lambda Exonuclease 1000 units
Lambda Exonuclease 5000 units
Exonuclease I 4000 units
Exonuclease I 20000 units
Endonuclease IV, E.coli 100 units
RNase I 1000 units
RNase I 5000 units
RiboLock™ RNase Inhibitor 2500 units
RiboLock™ RNase Inhibitor 4x2500 units
三磷酸腺苷結(jié)合盒亞家族G1抗體
脂聯(lián)素受體2抗體
ANGEL1蛋白抗體
ANGEL2蛋白抗體
ANKLE2蛋白抗體
睪丸特異性錨樣蛋白1抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白13B抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白20A1抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白20A3抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白22抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白50抗體
氫離子轉(zhuǎn)運ATP合成酶6G抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白26抗體
錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域蛋白26抗體
丙型肝炎病毒核結(jié)合蛋白-1抗體
芳香基硫酸酯酶K抗體
神經(jīng)元突觸前膜蛋白抗體
錨定蛋白G抗體
肌動蛋白α/α-SMA/α Actin抗體
MTT檢測試劑盒整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶1型抗體
整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶1型-7抗體
整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶1型-7抗體
內(nèi)收蛋白抗體
脂肪組織分化相關(guān)蛋白抗體
化工儀器網(wǎng)