免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析 。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。

WB檢測之內(nèi)參抗體

Western Blot檢測方法不僅能檢測靶蛋白存在與否， 還能比較不同條件下或者不同組織中靶蛋白的相對表達(dá)量，可作為蛋白表達(dá)水平最直接的證據(jù)。在WB實驗中有眾多不確定因素影響靶蛋白表達(dá)水平的測定，如方法學(xué)本身性質(zhì)、操作誤差等。為準(zhǔn)確衡量靶蛋白表達(dá)水平，需要精確一致的上樣量，使用內(nèi)參的意義即是保證上樣量的一致。內(nèi)參即內(nèi)部參 照(Internal Control) ， 對哺乳動物細(xì)胞一般指管家基因的表達(dá)蛋白(Housekeeping Proteins) 。此類蛋白在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定， 可作為檢測蛋白表達(dá)水平變化的參照物。當(dāng)內(nèi)參條帶亮度基本一致時，基本可以確定上樣量是一致的，通常采用比較靶蛋白和內(nèi)參蛋白條帶亮度比值來進(jìn)行相對定量。

WB實驗中涉及到的蛋白-抗體結(jié)合是一個復(fù)雜的活性生物大分子間的相互作用，眾多因素都會影響實驗的結(jié)果。例如時間、溫度、濃度、離子強度等。

內(nèi)參使用方法

1.標(biāo)記內(nèi)參：酶標(biāo)的內(nèi)參抗體可避免二抗結(jié)合總蛋白中某些免疫球蛋白產(chǎn)生的雜帶，使用時只需在二抗孵育時加入酶標(biāo)內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

2.普通內(nèi)參：當(dāng)靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差不大時，可先對靶蛋白進(jìn)行顯色檢測， 然后用Strip緩沖液洗掉膜上抗體， 重新對內(nèi)參蛋白進(jìn)行顯色檢測。當(dāng)靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差較明顯時，可對轉(zhuǎn)膜預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量將膜剪為兩部分并分開進(jìn)行靶蛋白和內(nèi)參蛋白的顯色檢測。內(nèi)參抗體選擇常用的蛋白內(nèi)參有GAPDH和β-actin或β-tubulin， 內(nèi)參的選擇原則是選擇與靶蛋白分子量相差5KD以上的內(nèi)參，對不同的樣本則需要根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇。

1.根據(jù)物種選擇

哺乳動物來源的組織或細(xì)胞樣本通常選擇β-actin、 β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H 3、Na'/K'-ATPase等。植物來源的樣本常選擇plant actin、Rubisco等。對于其他研究稀少的物種可參考報導(dǎo)的文獻(xiàn)進(jìn)行選擇。以GAPDH為例， 抗GAPDH單抗(ABGENT， clone6C 5) 能夠與非洲蟾蜍、猴、豬、羊、狗、貓、魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應(yīng)， 但不能與酵母GAPDH反應(yīng)。

2根據(jù)組織類型選擇

以肌動蛋白actin為例， 肌動蛋白actin在不同物種之間高度保守， 且同一物種類型actin的序列相似性大于90%， 使其很難獲得特異性較好的抗actin抗血清。但物種不同類型actin的N段序列相似性僅50~60%， 故Ｎ端序列常被用來制備抗actin體。脊椎動物肌動蛋白分為α、 β和y三種類型， a型分布于心肌、橫紋肌細(xì)胞利肌細(xì)胞中， y型分布于平滑肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞中，β型分布于非肌細(xì)胞中，共六種蛋白， 不同廠商生產(chǎn)抗B-actin抗體過程中選擇的免疫區(qū)段在不同型actin之間的否影響到抗體的組織特異性。選用β-act inN端的16個氨基酸序列制備的單多抗占數(shù)， 這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用β-act inC端16個氨序列制備的抗體則可以在肌肉細(xì)胞中檢測到actin的信號。

3.根據(jù)蛋白組分選擇

提取細(xì)胞蛋白組分過程中，胞漿蛋白通常是最先提取出來的。離心全細(xì)胞裂解液的上清含胞漿蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，繼續(xù)加大裂解程度即可提取到胞白，最后才能提取到胞膜蛋白。通過特殊的方法還可以從胞漿蛋白中提取到線粒體蛋葉綠體蛋白等。針對不同的細(xì)胞組分需要選擇不同的內(nèi)參抗體。

在選擇細(xì)胞總蛋門內(nèi)參時.GAPDH、P-actin, tubulin^種內(nèi)參冋時發(fā)生變化的情況 很少，如出現(xiàn)這種情況.可用胞核內(nèi)參戻至線粒體內(nèi)參代替。另外.不同的實驗冃的應(yīng)選 樣不同的內(nèi)參，例如檢驗質(zhì)核分離效果應(yīng)選擇胞漿蛋白內(nèi)參actin.抽提的核組分中檢測 不到actin則表示質(zhì)核分離效果較好。

總之,內(nèi)參的選擇要根據(jù)實際情況而定.不僅要考慮到物種、組織、組分等因素。還需要考慮到實際的實驗設(shè)計。如實驗設(shè)計中包括組織缺氧、糖尿病等因素變量.則不適宜選擇GAPDH作內(nèi)參，研究細(xì)胞增殖的相關(guān)實驗中則不適宜選c-Jun作內(nèi)參.在凋亡實驗中則要避免使用TBP、Lamin等。