本試劑盒根據(jù)鳥類多瘤病毒（Avian Polyoma Virus，APV）基因中的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，并對檢測體系進(jìn)行了針對性優(yōu)化，可針對鳥類羽毛、血液、組織及口腔/泄殖腔拭子等樣品中APV 的特異核酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以進(jìn)行結(jié)果判定。

實(shí)驗(yàn)操作：

1. 樣本制備（樣本制備區(qū)）

請參照動(dòng)物基因組DNA快速提取試劑盒（PCR分析用）說明書，或其他符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的核酸提取試劑盒/方法，對處理后的樣本進(jìn)行核酸提取。提取的樣本核酸盡量及時(shí)進(jìn)行檢測，放置于冰盒中，否則于 4℃或-20℃保存。

 

2. 配制反應(yīng)體系（加樣區(qū)）

•  按照樣本數(shù)量（n+2，n為樣本數(shù)，每次實(shí)驗(yàn)建議設(shè)置 1 個(gè)陽性對照，1 個(gè)陰性對照）配制反應(yīng)液，具體配制方法如下：分別吸取（（n+2）*7.5µL無酶無菌水+（n+2）*10µL APV反應(yīng)液+（n+2）*1µL APV引物Mix）加入潔凈離心管中，充分吹吸混勻，分裝至0.2mL PCR 管（離心管）中，每孔18µL（如樣本過多，可提前預(yù)制，于 2~8℃短暫保存，2 小時(shí)內(nèi)使用）

 

• 向反應(yīng)液中依次添加 2μL無酶無菌水（陰性對照）、樣本核酸和APV陽性對照，蓋好 管蓋，做好記錄，反應(yīng)總體積為 20μL。充分混勻，離心 30 秒后進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

 

3. PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

95℃預(yù)變性 5 分鐘；94℃變性 45 秒，55℃退火 45 秒，72℃延伸 45 秒，共 35 個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸 5 分鐘；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物先放置于 4℃（-20℃約 5 分鐘）條件下充分冷卻（15 分鐘）

4. 瓊脂糖凝膠電泳（以水平電泳瓊脂糖凝膠制備為例）

• 根據(jù)制膠量及凝膠濃度（1%~1.5%），量取一定量的電泳緩沖液，倒入三角錐形瓶中。

注：制膠緩沖液和電泳緩沖液需一致。

 

• 準(zhǔn)確稱量瓊脂糖，小心加入三角錐形瓶中。在錐形瓶的瓶口蓋上牛皮紙或封口膜，置

于微波爐中或電磁爐上加熱溶解。加熱至溶液沸騰后，請戴上防熱手套，小心晃動(dòng)錐形瓶，如 此重復(fù)數(shù)次，直至瓊脂糖溶解。

注：瓊脂糖溶解過程采用多次短暫沸騰的方法，避免溶液過熱暴沸。保證瓊脂糖充分溶解，以免造成電泳圖像模糊不清。

 

• 充分溶解的瓊脂糖稍冷卻后，加入適量核酸染料，輕微充分搖勻（避免產(chǎn)生大量氣泡）。

 

• 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在 3~5mm之間。

 

•  室溫下待膠凝固（大約 30 分鐘~1 小時(shí)），小心拔出梳子，將凝膠置于事前加入電泳緩沖液的電泳槽中，保證電泳緩沖液沒過凝膠。

 

•  取 5μL DNA Marker以及 10μL經(jīng)瞬時(shí)離心冷卻后的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別加入凝膠的各個(gè)點(diǎn)樣孔中，所有樣本點(diǎn)樣完成后，靜置 2 分鐘后，接通電泳槽電源，根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置電壓（70~120V）及電泳時(shí)間（20-30 分鐘）。

 

5. 結(jié)果判定

• APV陽性對照在 200bp左右出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，且陰性對照無目標(biāo)擴(kuò)增條帶，則結(jié)果成立。

•  樣本檢測結(jié)果在 200bp左右出現(xiàn)一條擴(kuò)增主條帶，表明待檢樣本中存在APV核酸，則

判定為APV陽性。

• 樣本檢測結(jié)果無目標(biāo)擴(kuò)增條帶，表明樣本中未檢測出APV核酸，則判定為APV陰性。