高效液相色譜分析中，色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞，選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發(fā)所需的時間，并且使方法更具穩(wěn)定性。但是我們要清楚現(xiàn)在商品化的液相色譜柱比比皆是，根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個初步的選擇，但由于各個儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異。即使都是C18柱，不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。那就要求我們要對各種類型的色譜柱做充分的了解之后，才能做出合適的選擇。下面我們來講講如何選擇色譜柱吧！

選擇色譜柱時我們首先要考慮的就是選擇填料的孔徑大小，這怎么來選擇呢，那么我們就要對自己所分析的物質(zhì)做充分的了解，首先要知道的就是被分析物的分子量，對于分子量＜2000的小分子物質(zhì)我們選擇孔徑80 - 120 孔徑的填料， 而對于分子量 ＞2000多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)則需要300 孔徑的填料對其進(jìn)行等度或梯度分離。選擇到合適孔徑大小的填料之后我們才能夠保證目標(biāo)分子能進(jìn)入填料，在空隙中與疏水性固定相發(fā)生相互作用。

選擇完填料的粒徑之后，我們就到了選擇鍵合相的環(huán)節(jié)，這一步呢我們就需要多做實驗多試，大多數(shù)色譜工作都是從C18鍵合相開始的，在這里呢，我也建議大家將C18作為開始分析的鍵合相，因為其可以*大限度地保留中等極性到非極性化合物。如果用 C18 鍵合相不能優(yōu)化分離度，或要分析的是蛋白質(zhì)，或用常規(guī)反相溶劑很難從C18上洗脫的強(qiáng)疏水化合物，這時候可以考慮使用短鏈鍵合相如：C8、C3。

色譜柱填料的粒徑，影響色譜分離度。粒徑越小，分離越快，柱效越高，但柱壓力越高，柱容易被污染，導(dǎo)致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料，復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑，更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍，因此如何選擇填料粒徑需要我們根據(jù)實際情況而定。

在這里我們要清楚柱越長，分離度越高，但柱壓更高，分離所需時間更長；如果想要得到較高的分離度，在壓力和時間允許的情況下盡量選擇長柱，如250mm。如果想要縮短分析時間并且對分離度的要求不高，建議大家使用短柱，可以節(jié)約時間，如50mm。

一般來說，反相LC 的流動相包括水和作為改性劑的乙腈或甲醇。改性劑還有四氫呋喃（THF）和異丙醇。反相色譜中流動相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨 pH 改變而明顯變化。在這類反相系統(tǒng)中，控制 pH 對于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要。通常在 pH 2 到 4 條件下，保留時間對pH的微小改變穩(wěn)定性*高，因此色譜工作者將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。

為了有較好的重現(xiàn)性，所用的 pH 應(yīng)高于或低于待分離溶質(zhì)pKa或pKb上下一個pH單位。如果不清楚分析物的pKa，建議大家測試一種以上流動相 pH 可提供*好結(jié)果。大多數(shù)反相柱都可以在pH 2-8條件下使用，這樣為分離選擇*佳流動相 pH 提供了較寬的范圍。流動相 pH 對色譜分離的影響有多種方式。根據(jù)所分析的化合物，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是可離子化的化合物，如酸或堿，保留因子和選擇性隨 pH的改變變化非常明顯，如果是非極性較強(qiáng)或中性的化合物，pH 對分離度和保留的影響一般不明顯。

在開發(fā)可離子化分析物的分析方法時，我們一定要清楚非離子化形態(tài)的分析物比離子化形態(tài)的分析物保留更好，所以我們調(diào)節(jié)流動相的pH值，其目的就是防止可離子化分析物離子化。對于酸性分析物而言，應(yīng)選擇低 pH 緩沖液流動相，以防止分析物離子化。我們了解了分析物的 pKa，才能夠有效地選 擇流動相 pH。緩沖范圍應(yīng)在其緩沖液離子 pK 值的 +/-1 pH 單位，使流動相的優(yōu)化具有一定的靈活性。例如， 醋酸鹽的 pKa 為 4.8，緩沖范圍從 pH 3.8-5.8。甲酸鹽的酸性較大，緩沖范圍為 pH 2.8-4.8。對于堿性化合物而言，在高 pH 條件下才能得到其非離子化形態(tài)，但這對色譜柱不利。但許多堿性化合物在 低 pH 條件下的保留就已經(jīng)足夠了。因此，雖然非離子化形態(tài)能得到更高的保留，但這對與所有的堿性化合物并不是實用和必要的。在流動相的選擇這一塊以下幾點相當(dāng)重要，恕小編冒昧，請大家爛熟于心哦。

• 離子抑制形態(tài)下的分析物具有更好的保留（例如，低pH下的酸和高pH下的堿） 。

• 在中性和較高pH下，硅膠上的硅醇基發(fā)生離子化，增加了堿性分析物的保留（例如，可能發(fā)生離子交換相互作用） 。

• 在方法開發(fā)過程中，可選擇流動相pH對保留和選擇性進(jìn)行優(yōu)化。

• 為延長柱壽命，避免使用j端 pH 值（*或極低）?？梢允褂镁彌_液幫助調(diào)節(jié) pH 值。緩沖液可以保持pH不變，提高重現(xiàn)性。

• 選擇流動相改性劑時，一定要考慮檢測器；與 UV 檢測器匹配良好的改性劑不一定與 MS 檢測器兼容。

• 成功的HPLC分離不必*抑制離子化，通常在流動相緩沖容量足夠的情況下，90% 的抑制即可。

• 流動相的緩沖容量與配制的摩爾濃度，以及洗脫液的 pH 與緩沖離子 pK 的接近程度有關(guān) 通常在高于或低于緩沖離子 pK 1 個 pH 單位內(nèi)，可以起到緩沖效果。

• 色譜操作者也可以選擇非緩沖的流動相進(jìn)行 pH 調(diào)節(jié)。這對于酸性分析物而言也是常用的，用單一的酸溶液進(jìn)行色譜分離，酸的濃度應(yīng)足以使pH比需要值低得多，以防止化合物離子化。

• 對于堿性物質(zhì)的分離，選擇是比較有限的。TEA（三乙胺）不能*溶于水，而且 pK (11) 很高，氨本身可以*溶于水，但對大多數(shù)色譜柱來說pK值過高。

• 測定流動相pH時，要在水相與有機(jī)改性劑混合之前在水相中進(jìn)行測定，以確保得到準(zhǔn)確而可重復(fù)的結(jié)果。

• 選擇緩沖鹽時注意緩沖鹽與檢測的相容性，對于UV檢測器來說，在目標(biāo)波長下緩沖液應(yīng)*透光。緩沖液UV截止波長*好低于220 nm。

• 流動相會因為實驗室中的混合方式而不同。例如，如果要配制甲醇/水=50/50的混合溶劑，應(yīng)先量取各自的體積，分別置于潔凈的玻璃容器中，然后再將其混合，因為甲醇和水混合溶劑的總體積大于各自體積之和。如果在同一個容器中混合，混合溶劑的總體積就會不同。

• 流動相脫氣也很重要。在流路中，溶解在溶劑中的氣體可能逸出，形成氣泡，并有可能干擾泵或檢測器的性能。因此我們在配置好流動相之后一定要對其進(jìn)行脫氣處理，脫氣處理完之后切記不要再對其進(jìn)行劇烈振搖。

• 使用正常工作的 pH 計。按照目標(biāo)pH值校正pH計。用pH計對pH進(jìn)行可靠的測量非常重要。

• 確保試劑盡可能新鮮。

• 先把固體溶解在非常接近終體積的液體中。調(diào)節(jié)pH到目標(biāo)值后，再添加液體使溶液達(dá)到目標(biāo)體積。

• 緩沖液配制完成后，在 HPLC 系統(tǒng)上使用之前要進(jìn)行過濾，去除水或鹽中可能存在的顆粒。大多數(shù)HPLC應(yīng)用都使用0.45 m濾膜；UHPLC則使用0.22 m濾膜。

做分析方法開發(fā)我們需要二極管陣列檢測器，選擇檢測波長和做色譜峰純度檢查，通過色譜 峰純度檢查來保證主峰里沒有掩蓋其它雜質(zhì)，做純度檢測對波長選擇的要求比較簡單，原則 是把盡量多的雜質(zhì)在色譜圖上體現(xiàn)出來。很多雜質(zhì)只有在低波長下才有紫外吸收，所以我們 選擇盡可能低的波長，乙腈的截止波長在 190~195nm，用乙腈做流動相檢測波長可以選擇 在 210~220nm。也有公司要求分別選取產(chǎn)品紫外吸收*強(qiáng)的波段和 210~220nm 兩個波段做 對比，哪個純度低以哪個為準(zhǔn)，這樣可以更嚴(yán)格的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

更緩的梯度斜率可以提高分離度，降低梯度斜率將降低靈敏度， 更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經(jīng)常會導(dǎo)致分離度的降低， 增加梯度斜率將增加靈敏度， 改變梯度斜率時要平衡峰高與分離度的關(guān)系。

溫度會影響色譜分析中的每一個化學(xué)過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優(yōu)化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導(dǎo)致選擇性發(fā)生*變化。在這里我們要注意選擇柱溫一要考慮色譜柱的承受范圍，二要考慮該溫度下，檢測成分是否會降解。