新鮮冰凍血漿解凍箱*章解凍的FFP誘導內(nèi)皮細胞NO分泌機制及功能研究 失血性休克(Hemorrhagic shock, HS)是軍民和居民戰(zhàn)(創(chuàng))傷死亡的主要原因。在臨床治療過程中,與傳統(tǒng)復蘇液乳酸林格氏液(lactated ringer, LR)相比,新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma, FFP)因其在復蘇病員中提高患者生存率,具有一定的優(yōu)勢,被臨床創(chuàng)傷救治廣泛采用。而一氧化氮(nitric oxide, NO)是介導內(nèi)皮細胞功能重要分子,我們設想FFP復蘇失血性休克的療效可能得益于誘導NO分泌和舒張血管。為了探討FFP復蘇作用分子機制,本文采用NO/Nitrite/Nitrate分析法首先檢測了HS大鼠模型FFP及LR復蘇后不同時間點血清中NO含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFP復蘇后HS大鼠血清中NO含量顯著增加(p0.05)。與單獨HS組大鼠相比,FFP復蘇組HS大鼠血清中NO含量增加幅度大,出現(xiàn)時間早(p0.05),而LR復蘇卻降低大鼠HS復蘇后各時間檢測點NO含量。同樣對體外培養(yǎng)人肺正常微血管內(nèi)皮細胞(HPMECs)和人淋巴管內(nèi)皮細胞(HDLECs)FFP處理后NO含量進行分析,結(jié)果FFP處理后血管內(nèi)皮細胞NO生成同樣增加,與對照組相比統(tǒng)計學有顯著性差異(p0.05)。為了探討FFP復蘇對HS大鼠血管舒張功能的影響,隨后測定各組大鼠乙酰膽堿誘導內(nèi)皮依賴性血管舒張反應,與單獨HS組相比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFP復蘇顯著增加乙酰膽堿誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(分別是49±4mmHg與37±4 mmHg)(p0.05)。進一步探討FFP誘導內(nèi)皮細胞NO分泌分子機制,采用磷酸化蛋白激酶抗體芯片和免疫印跡方法篩選和鑒定FFP處理后內(nèi)皮細胞相關蛋白激酶磷酸化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)為FFP顯著增加兩株內(nèi)皮細胞12種蛋白激酶磷酸化,且在兩株內(nèi)皮細胞中FFP均能誘導AMPKα1,Akt1和eNOS磷酸化。FFP誘導eNOS磷酸化在FFP復蘇HS大鼠的肺組織中同樣得到了證實。表明FFP體內(nèi)外均能激活AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉(zhuǎn)導通路。分別采用Compound C(AMPK的抑制劑),LY294002(PI3K／Akt抑制劑)或L-NAME(NOS抑制劑)預處理HPMECs細胞,阻擋AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉(zhuǎn)導通路,結(jié)果為上述三種抑制劑均能抑制FFP誘導eNOS激活和NO生成,提示AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉(zhuǎn)導通路激活介導FFP誘導NO分泌和血管舒張。 本項目報道FFP誘導增加HS大鼠血清和體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞上清NO含量,并進一步篩選和鑒定出AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉(zhuǎn)導通路介導FFP誘導NO分泌和血管舒張,揭示了FFP復蘇保護血管內(nèi)皮細胞新機制。為了進一步探討FFP誘導血管內(nèi)皮細胞增加NO抑制HS誘導血管收縮改善微循環(huán)及修復內(nèi)皮細胞功能提供科學依據(jù)。 第二章解凍的FFP對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響及機制研究 失血性休克是創(chuàng)傷后死亡的首要原因。zui近的臨床研究表明,盡早、盡快地采用新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma, FFP)進行復蘇能顯著改善臨床失血性休克復蘇效果。為了滿足各地救治中心對FFP日益增長的需求及快速便捷獲得FFP,經(jīng)批準新鮮解凍血漿4℃貯存不多于5天仍可用臨床復蘇。研究報道FFP中含有高濃度與內(nèi)皮細胞遷移有關的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transform growth factor-β, TGF-β)。由此我們設想FFP可能促進內(nèi)皮細胞遷移,貯存的FFP可能改變了生長因子水平和信號轉(zhuǎn)導,從而降低FFP療效。本項目以遷移力作為功能研究著眼點,比較新鮮解凍血漿(FFP Day 0)和4℃貯存5天FFP(FFP Day 5)在正常氧供和缺氧條件下誘導內(nèi)皮細胞遷移能力及其對內(nèi)皮細胞TGF-p信號轉(zhuǎn)導通路影響以及FFP貯存過程中TGF-p濃度變化。FFP(Day 0)和FFP(Day 5)分別處理人肺微血管內(nèi)皮細胞(Human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMECs)和人淋巴管內(nèi)皮細胞(human dermal lymphatic endothelial cells, HDLECs)后,行遷移實驗和Western印跡分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)在正常供氧和缺氧條件下,FFP(Day 0)和FFP(Day 5)均能促進細胞遷移,而FFP(Day 5)促進細胞遷移能力顯著下降(p0.05)；2)FFP(Day 0)與FFP(Day 5)相比,TGF-β1水平顯著升高(p0.05)；3)抑制TGF-βI型受體ALK5的活性后,增強FFP(Day 0)和FFP(Day 5)誘導內(nèi)皮細胞遷移能力；4)FFP處理后顯著增加TGF-p信號轉(zhuǎn)導通路關鍵分子Smad2／3磷酸化,預處理ALK5活性可抑制其磷酸化。在體外培養(yǎng)兩株內(nèi)皮細胞中,FFP(Day 5)誘導增加Smad2／3磷酸化幅度大,與FFP(Day 0)相比,具有顯著性差異(p0.05)。結(jié)果表明TGF-β1／ALK5／Smad2／3信號轉(zhuǎn)導通路參與抑制FFP誘導內(nèi)皮細胞遷移,標準貯存導致TGF-β1水平升高和增加TGF-β1／ALK5／Smad2／3信號通路轉(zhuǎn)導進而削弱FFP促進內(nèi)皮細胞遷移。 本項目報道FFP不管是在正常供氧還是在缺氧條件下均能誘導內(nèi)皮細胞遷移,貯存將增加細胞因子TGF-β1水平及增強TGF-β1/ALK5/Smad2/3信號通路轉(zhuǎn)導,并降低FFP誘導內(nèi)皮細胞遷移,為進一步探討FFP通過誘導內(nèi)皮細胞遷移參與失血性休克后血管內(nèi)皮完整和功能的恢復提供科學依據(jù)。