地龍為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓 Pheretima
aspergillum (E. Perrier)，習(xí)稱“廣地龍”[1]，性味咸
寒，現(xiàn)代藥理研究表明，地龍具有溶栓、抗腫瘤、
增強(qiáng)免疫力、降壓鎮(zhèn)靜、改善微循環(huán)和心腦血管病
理狀態(tài)、調(diào)節(jié)肝臟等作用，其主要活性成分是可溶
性蛋白質(zhì)[2-6]。有研究發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白是地龍溶血
栓、抗血栓的主要活性物質(zhì)[7]。
目前，對(duì)從地龍中提取得到地龍蛋白的工藝研
究較多[8-9]，但對(duì)已獲得的活性蛋白后續(xù)處理工藝的
研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)旨在能夠zui大程度確保其活
性組分有效性的基礎(chǔ)上，通過工藝處理后，較穩(wěn)定
地保存已提取蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)結(jié)合
Box-Behnken 響應(yīng)面法[10]，以凍干率為指標(biāo)，優(yōu)化
地龍活性組分的凍干工藝，采用 HPLC 法，測定優(yōu)
化后工藝樣品的指紋圖譜，并比較其與地龍藥材指
紋圖譜相似度，確定*凍干工藝，為地龍同體制
劑的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 儀器與試劑
UV-2600 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公
司；電子分析天平，梅特勒-托利多（上海）儀器有
限公司；LYO-0.5（CIP）真空冷凍干燥機(jī)，上海東
富龍科技股份有限公司；SPX-250BZ 型生化培養(yǎng)
箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TD-WS
臺(tái)式低速離心機(jī)，長沙湘鷹離心機(jī)有限公司；安捷
倫 1260 液相色譜儀系統(tǒng)，美國安捷倫公司；相似度
軟件為“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，中國
藥典委員會(huì)。17 種氨基酸混合對(duì)照品（門冬氨酸、
谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨
酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、
異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸）、
衍生試劑 A（異硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生試劑
B（三乙胺-乙腈溶液）均來自月旭公司氨基酸分析
包；尿激酶、凝血酶（牛血）、纖維蛋白原（牛血）
均購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為
140604-201224、140605-201125、140607- 201338；
瓊脂糖，BR 級(jí)，批號(hào) 121129，上海如吉生物科技
發(fā)展有限公司；地龍對(duì)照藥材，批號(hào) 120987-201107，
購自中國食品藥品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈
純凈水；其他試劑為分析純。地龍藥材購自亳州中
藥材市場，產(chǎn)地廣東佛山，批號(hào) 20131106，經(jīng)湖北
省藥學(xué)會(huì)中藥鑒定分會(huì)陳科力教授鑒定為鉅蚓科動(dòng)
物參環(huán)毛蚓 Pheretima aspergillum (E. Perrier) 的干
燥體。
2 方法與結(jié)果
2.1 地龍藥材提取物的制備
稱取地龍粗粉 100 g，加水 500 mL，浸泡 60
min，超聲處理（250 W，50 Hz）60 min，12 000 r/min
離心 10 min，得上清液。分別將 A、B 2 種衍生試
劑用乙腈稀釋至原來濃度的 1/5，精密量取上清液 1
mL，置于試管中，加入稀釋后的 A 溶液 0.5 mL 和
稀釋后的 B 溶液 0.5 mL，渦旋混合 1 min，在 50 ℃
水浴中加熱 45 min，取出，加入正己烷溶液 1 mL，
振搖，渦旋混合 1 min，靜置 30 min，吸取下層澄
清液體，用孔徑為 0.45 μm 有機(jī)濾膜濾過，即得到
衍生化后的樣品溶液。
2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)
2.2.1 凍干率[11] 凍干率是物料凍干后脫水質(zhì)量
占物料水分總量的比例，本實(shí)驗(yàn)采用費(fèi)休氏水分測
定法測定樣品中的含水量從而計(jì)算出凍干率。
凍干率＝1－含水量
2.2.2 指紋圖譜相似度分析[12-13]
（1）對(duì)照品溶液的制備：取 Welch 公司 17 種
氨基酸混合對(duì)照品溶液（原濃度）用水稀釋至原來
濃度的 1/10 作為對(duì)照品溶液。
（2）色譜條件：色譜柱為 Ultimate Amino Acid
AAA 氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，月
旭材料科技有限公司）；體積流量 1.0 mL/min；柱溫
40 ℃；進(jìn)樣量 5 μL；檢測波長 254 nm。流動(dòng)相 A
為 0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（pH 6.5）-乙睛（93∶7）；
流動(dòng)相 B 為水-乙腈（20∶80），二元梯度洗脫，洗
脫程序：0～11 min，100%～93% A；11～13.9 min，
93%～88% A；13.9～14 min，88%～85% A；14～
29 min，85%～66% A；29～32 min，66%～30% A；
32～35 min，30%～0% A；35～45 min，0% A；45～
60 min，100% A。
（3）精密度試驗(yàn)：取“2.1”項(xiàng)下衍生化后供試
品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次。將 6 次
測定圖譜轉(zhuǎn)化為 AIA 格式后依次導(dǎo)入相似度軟件，
輸出 17 個(gè)共有峰峰面積的 RSD 為 0.12%～3.43%，
保留時(shí)間的 RSD 為 0.04%～0.31%，表明儀器精密
度良好。
（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.1”項(xiàng)下制備的同 1 份
衍生化后供試品溶液，在上述色譜條件下分別在 0、
2、4、6、8、12、24、48、72 h 進(jìn)樣，進(jìn)行測定。
測定圖譜轉(zhuǎn)化為 AIA 格式后依次導(dǎo)入相似度軟件，
輸出 17 個(gè)共有峰峰面積的 RSD 為 0.17%～2.81%，
·3168· 中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
保留時(shí)間的 RSD 為 0.03%～0.13%，表明樣品在 72
h 內(nèi)穩(wěn)定。
（5）重復(fù)性試驗(yàn)：取“2.1”項(xiàng)下平行制備的 6
份衍生化后供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測
定。測定圖譜轉(zhuǎn)化為 AIA 格式后依次導(dǎo)入相似度軟
件，輸出 17 個(gè)共有峰峰面積的 RSD 為 0.41%～
3.58%，保留時(shí)間的 RSD 為 0.03%～0.15%，表明方
法的重復(fù)性良好，證明分析方法和提取工藝的穩(wěn)定
性和可靠性。
（6）共有圖譜的建立：取“2.1”項(xiàng)下的衍生化
后供試品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 10 次，
取對(duì)照品溶液，按色譜條件項(xiàng)下條件進(jìn)行測定并標(biāo)
示，如圖 1 所示，峰 1～17 為地龍氨基酸組分提取
物中含有的 17 種氨基酸成分，分別為門冬氨酸、谷
氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、
丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮
氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸。其中
峰 10（胱氨酸）在 HPLC 圖譜中分離良好，質(zhì)量分
數(shù)較高且穩(wěn)定，所以選擇其為參照峰，共標(biāo)示了 17
個(gè)共有峰。
1-門冬氨酸 2-谷氨酸 3-絲氨酸 4-甘氨酸 5-組氨酸 6-精氨酸 7-蘇氨酸 8-丙氨酸 9-脯氨酸 10-胱氨酸 11-纈氨酸 12-蛋氨酸
13-異亮氨酸 14-亮氨酸 15-酪氨酸 16-苯丙氨酸 17-賴氨酸
1-aspartic acid 2-glutamic acid 3-serine 4-glycine 5-histidine 6-arginine 7-threonine 8-alanine 9-proline 10-cystine acid 11-valine
12-methionine 13-isoleucine 14-leucine 15-tyrosine 16-phenylalanine 17-lysine
圖 1 地龍氨基酸組分提取物參照?qǐng)D譜
Fig. 1 Reference fingerprint of extract components of amino acid in lumbricus
2.3 凍干工藝單因素試驗(yàn)考察
2.3.1 共晶點(diǎn)（共融點(diǎn)）的測定及預(yù)凍溫度的確定
溶液裝入 10 mL 燒杯中，置于凍干機(jī)前箱，插入共
晶點(diǎn)探頭及溫度探頭，啟動(dòng)共晶點(diǎn)測定儀，設(shè)定凍
干機(jī)預(yù)凍溫度為−50 ℃，預(yù)凍 3 h，測定共晶點(diǎn)。
按照凍干理論[7]，為保證物料*凍結(jié)，產(chǎn)品預(yù)凍
溫度一般應(yīng)選擇在共晶點(diǎn)溫度以下 5～15 ℃為宜，
經(jīng)測定該制品溶液的共晶點(diǎn)為−16.5 ℃，共融點(diǎn)為
−17.9 ℃，據(jù)此推測預(yù)冷凍溫度應(yīng)低于−26.5 ℃，
為確保產(chǎn)品在預(yù)凍時(shí)*凍結(jié)，試驗(yàn)選擇−26.5 ℃
為預(yù)凍溫度。
2.3.2 預(yù)凍時(shí)間的確定 精密吸取地龍藥液，在
−26.5 ℃下預(yù)凍，在−25 ℃進(jìn)行升華干燥 16 h，40
℃進(jìn)行解析干燥6 h，壓力維持在15 Pa左右[14]，
預(yù)凍時(shí)間分別設(shè)置為 2、3、4、5 h，以凍干產(chǎn)品外
觀性狀和凍干率為指標(biāo)考察不同預(yù)凍時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)
量的影響，結(jié)果見表 1。預(yù)凍時(shí)間僅 2 h 時(shí)，凍干產(chǎn)
品外觀收縮，呈黃色團(tuán)塊，隨著預(yù)凍時(shí)間的延長，
產(chǎn)品的性狀良好，質(zhì)地疏松，在預(yù)凍時(shí)間為 4～5 h
時(shí)，凍干品的外觀及凍干率質(zhì)量，因此確定預(yù)
凍時(shí)間為 4 h。
2.3.3 升華干燥溫度對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗(yàn)
1
2
3
4
5
8
6
7 9
10
11
12
13
14
15
16
17
0 5 10 15 20 25 30 35
t/min
中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月 ·3169·
表 1 預(yù)凍時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 1 Effects of pre freezing time on product quality
預(yù)凍時(shí)間/h 性狀 凍干率/%
2 收縮，黃色團(tuán)塊 50.00
3 略有鼓泡，淡黃色塊狀物，
質(zhì)地疏松
93.46
4 淡黃色塊狀物，質(zhì)地疏松 94.31
5 淡黃色塊狀物，質(zhì)地疏松 94.33
升華干燥又稱第 1 階段干燥，是指凍結(jié)產(chǎn)品中的冰
晶升華成水蒸氣逸出而使產(chǎn)品脫水干燥。當(dāng)全部冰
晶除去時(shí)，第 1 階段干燥完成，此時(shí)除去全部水分
的 90%左右。升華時(shí)所需熱量由擱板供給，產(chǎn)品在
干燥時(shí)期溫度必須低于其共融點(diǎn)的溫度，同時(shí)考慮
到產(chǎn)能，因此在−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h，壓
力維持在 15 Pa 左右，40 ℃進(jìn)行解析干燥 6 h 的條
件下，選擇升華干燥溫度−18、−20、−22、−24 ℃ 4
個(gè)水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見表 2。升華階段擱
板溫度在低于共融點(diǎn)下，溫度越高，產(chǎn)品的性狀良
好，質(zhì)地疏松，顏色均勻，產(chǎn)品凍干率提高；溫度
越低，在同等升華干燥時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)品外觀顏色深，
凍干率明顯降低，可能是產(chǎn)品干燥不充分，需要延
長升華干燥時(shí)間，但是從能耗角度，已經(jīng)不具備可
行性，因此確定升華干燥溫度−18、−20、−22 ℃作
為 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的 3 個(gè)水平。
表 2 升華干燥溫度對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 2 Effects of sublimation drying temperature on
product quality
擱板溫度/℃ 性狀 凍干率/%
−18 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 92.60
−20 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色較均勻 96.01
−22 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 94.18
−24 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，中間顏色深 88.75
2.3.4 升化時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗(yàn) 在
升華干燥階段，升華時(shí)間是很關(guān)鍵的因素，時(shí)間太
短，擱板溫度很快達(dá)到預(yù)定的溫度，使供給物料的
熱量也增加的過快，導(dǎo)致超過物料的共融點(diǎn)溫度使
其融化。因此在確定−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h，40
℃進(jìn)行解析干燥 6 h，暫定升華溫度為−20 ℃不變
的條件下，選擇以下 4 個(gè)時(shí)間段位因素進(jìn)行考察，
結(jié)果見表 3。進(jìn)入升華干燥階段，升華時(shí)間過短會(huì)
導(dǎo)致冰晶融化，凍干率很低，隨著升溫時(shí)間的延長，
產(chǎn)品性狀良好，時(shí)間過長會(huì)加長凍干周期且消耗不
表 3 升華時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 3 Effects of sublimation time on product quality
升華時(shí)間/h 性狀 凍干率/%
5 收縮，顏色不均勻 33.00
6 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 94.18
7 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 96.01
8 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.60
必要的能量，因此確定升華時(shí)間 6、7、8 h 作為
Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的 3 個(gè)水平。
2.3.5 解析干燥溫度對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗(yàn)
為了使產(chǎn)品達(dá)到合格的殘余含水量，必須對(duì)產(chǎn)品進(jìn)
一步干燥，產(chǎn)品的熱量主要靠擱板供給，所以在
−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h，−20 ℃進(jìn)行升華干燥 7
h 不變的條件下，選擇 20、25、30、35 ℃ 4 個(gè)溫
度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見表 4。在解析干燥階段，
隨著溫度的上升，凍干*，當(dāng)擱板溫度為 30
℃時(shí)，凍干產(chǎn)品性狀良好，骨架結(jié)構(gòu)完整，海綿狀，
顏色均勻，凍干效果已經(jīng)較好，隨著擱板溫度繼續(xù)
增高，凍干率也不能增加，且增加產(chǎn)能，因此確定
解析溫度 20、25、30 ℃作為 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)
驗(yàn)的 3 個(gè)水平。
表 4 解析干燥溫度對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 4 Effects of analytical drying temperature on
product quality
擱板溫度/℃ 性狀 凍干率/%
20 質(zhì)地疏松，黃色塊狀物，中間顏色
稍深
93.08
25 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 94.25
30 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.51
35 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.48
2.3.6 解析干燥時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗(yàn)
解析干燥時(shí)間同樣是影響凍干工藝樣品的參數(shù)之
一，因此在−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h，−20 ℃進(jìn)行
升華干燥 7 h，解析干燥溫度暫定為 30 ℃不變的條
件下，選擇以下 4 個(gè)時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表 5。
在解析干燥階段，隨著解析干燥時(shí)間的延長，凍干
*，凍干周期也延長，能耗越來越高，至解
析干燥 4 h 后，再延長時(shí)間，已基本無影響，因此
確定解析干燥時(shí)間 3.0、3.5、4.0 h 作為 Box-Behnken
設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的水平。
2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 通過預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)
·3170· 中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
表 5 解析干燥時(shí)間對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 5 Effects of analytical drying time on product quality
解析時(shí)間/h 性狀 凍干率/%
3.0 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.06
3.5 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.25
4.0 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 96.01
4.5 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.94
的考察，僅確定部分參數(shù)，其*工藝需進(jìn)一步優(yōu)
選，本實(shí)驗(yàn)選取升華干燥溫度（A）、升華時(shí)間（B）、
解析干燥溫度（C）、解析干燥時(shí)間（D）為考察因
素，以凍干率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 Box-Behnken 響應(yīng)
面法對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察各因素對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的綜
合影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表 6。方差分析見表 7。
2.4.2 回歸模型的建立及方差分析 采用 Design
表 6 地龍活性組分凍干工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
Table 6 Design and experimental results of process of freeze-dried optimization of active components in lumbricus
試驗(yàn)號(hào)
因素 凍干率/%
試驗(yàn)號(hào)
因素 凍干率/%
A/℃ B/h C/℃ D/h 實(shí)測 預(yù)測 A/℃ B/h C/℃ D/h 實(shí)測 預(yù)測
1 −18 (1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 94.06 94.44 15 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 3.0 (−1) 91.28 91.67
2 −18 (1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 93.90 93.63 16 −20 (0) 6 (−1) 35 (1) 3.5 (0) 94.66 94.36
3 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 4.0 (1) 93.82 94.21 17 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.57 96.62
4 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.50 96.62 18 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.79 96.62
5 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 4.0 (1) 94.45 94.81 19 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 3.0 (−1) 90.58 91.01
6 −22 (−1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 94.79 94.67 20 −22 (−1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 94.76 95.16
7 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 89.92 89.64 21 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 3.0 (−1) 90.66 90.37
8 −18 (1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 94.52 94.26 22 −22 (−1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 95.42 95.30
9 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 4.0 (1) 93.96 93.86 23 −18 (1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 91.12 91.82
10 −20 (0) 6 (−1) 25 (−1) 3.5 (0) 94.82 94.69 24 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 3.0 (−1) 90.82 90.69
11 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.96 93.84 25 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.07 92.80
12 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 4.0 (1) 93.79 93.54 26 −20 (0) 8 (1) 35 (1) 3.5 (0) 95.27 95.00
13 −20 (0) 8 (1) 25 (−1) 3.5 (0) 95.41 95.31 27 −22 (−1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 93.10 93.18
14 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 90.79 90.67
表 7 方差分析
Table 7 ANOVA regression analysis
方差來源 平方和 自由度 F 值 P 值 顯著性 方差來源 平方和 自由度 F 值 P 值 顯著性
A 3.23 1 17.71 0.001 2 ** A2 14.92 1 81.70 ＜0.000 1 **
B 1.19 1 6.52 0.025 3 * B2 1.25 1 6.84 0.022 6 *
C 0.30 1 1.66 0.221 3 C2 8.94 1 48.98 ＜0.000 1 **
D 30.08 1 164.75 ＜0.000 1 ** D2 55.00 1 301.20 ＜0.000 1 **
AB 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 殘差 2.19 12
AC 5.29 1 28.97 0.000 2 ** 失擬項(xiàng) 2.15 10 9.37 0.100 2
AD 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 純誤差 0.046 2
BC 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 總和 103.27 26
BD 1.23×10−3 1 6.71×10−3 0.936 1 變異系數(shù) 0.004 6
CD 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 校正決定系數(shù) 0.978 8
*
P＜0.05，模型或考察因素有顯著影響；**P＜0.01，模型或考察因素有極顯著影響
*
P < 0.05, model or investigation factor with significant effect; **P < 0.01, model or investigation factor with extremely significant effect
中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月 ·3171·
Expert 8.05 軟件，分別對(duì)各因素水平進(jìn)行多元線性
回歸和非線性回歸（二項(xiàng)式擬合），建立地龍活性組
分凍干率（Y）對(duì) 4 個(gè)因素（A、B、C、D）的 2 次
回歸模型方程為 Y＝96.62－0.52 A＋0.32 B－0.16
C＋1.58 D－0.002 5 AB－1.15 AC－0.005 AD＋
0.005 BC－0.017 BD－0.002 5 CD－1.67 A2－0.48
B2
－1.29 C2
－3.21 D2
。
經(jīng)方差分析（表 7）得知，自變量 1 次項(xiàng) B，2
次項(xiàng) B2顯著（P＜0.05），1 次項(xiàng) A、D，2 次項(xiàng) AC、
A2
、C2
、D2極顯著（P＜0.01），表明模型具有統(tǒng)計(jì)
學(xué)意義。失擬項(xiàng)用來表示所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程
度，即二者差異的程度，本例 P 值為 0.100 2＞0.05，
對(duì)模型是有利的，無失擬因素存在。進(jìn)一步，校正
決定系數(shù)（0.978 8＞0.80）和變異系數(shù)為 0.46%，
說明該模型只有 2.12%的變異，表明該模型擬合優(yōu)
度較好，可用該模型及回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測（預(yù)測結(jié)果見表 6）。
2.4.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗(yàn)證 各因素之間的
響應(yīng)面圖和等高線圖見圖 2，由 Design Expert 8.05
軟件分析得響應(yīng)面值z(mì)ui大時(shí)，A、B、C、D 對(duì)應(yīng)的
編碼值分別為 0、0、0、0，與之對(duì)應(yīng)的地龍活性組
分*凍干工藝條件為升華干燥溫度−20 ℃、升華
圖 2 Y 與 4 因素的三維效應(yīng)面圖和等高線圖
Fig. 2 3D Response surface plots and contour plots of Y and four factors
97
Y/%
B/h A/℃
B/h
A/℃ A/℃
Y/%
Y/%
Y/% Y/%
Y/%
Y/%
B/h C/℃
C/℃ D/h
C/℃ D/h D/h
−21 A/℃ −19
6.5 B/h 7.5 27 C/℃ 33
B/h
C/
℃
D/h
C/
℃
D/h
D/h
95
93
7.5
6.5
−19
−21
97
94
91
33
27
−19
−21
90
94
98
3.2
3.8
−21
−19
97
96
95
94
33
27
7.5
6.5
97
94
91
3.2
3.8
6.5
7.5
91
94
97
3.8
3.2
33
27
7.5
6.5 27
33
3.2
3.8
−21 A/℃ −19 −21 A/℃ −19
Y/% Y/%
27
33
3.2
3.8 3.8
3.2
6.5 B/h 7.5
Y/% Y/% Y/%
·3172· 中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
時(shí)間 7 h、解析干燥溫度 30 ℃、解析干燥時(shí)間 3.5 h，
此時(shí)凍干率的理論值達(dá) 96.62%。
2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)
為檢驗(yàn)單因素及響應(yīng)面預(yù)測的可靠性，選擇zui
佳凍干工藝條件（預(yù)凍溫度−26.5 ℃，預(yù)凍 4 h，升
華干燥溫度−20 ℃、升華時(shí)間 7 h、解析干燥溫度
30 ℃、解析干燥時(shí)間 3.5 h）進(jìn)行 3 批放大工藝驗(yàn)
證試驗(yàn)，測定凍干率，并為確認(rèn)本工藝不影響地龍
氨基酸組分的活性，將驗(yàn)證批樣品與對(duì)照藥材的氨
基酸指紋圖譜進(jìn)行相似性分析，判斷是否zui大程度
保留其活性組分的有效性[2-3]。
結(jié) 果 3 批樣品的凍干率分別為 96.59% 、
96.45%、96.61%，指紋圖譜相似度分別為 0.912、
0.905、0.915。采用*凍干工藝條件得到的地龍
提取物顏色均勻，性狀良好，測得凍干率在 96.55%，
與預(yù)測值 96.62%基本吻合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的凍
干工藝條件穩(wěn)定，與對(duì)照藥材的氨基酸指紋圖譜相
似度均大于 0.9，表明該工藝具備可行性。
3 討論
動(dòng)物藥活性成分以多肽和蛋白質(zhì)為主，地龍中
含量zui為豐富的物質(zhì)即為蛋白質(zhì)，但其主要成分氨
基酸類具有水溶性和對(duì)熱不穩(wěn)定的性質(zhì)，因此對(duì)提
取后活性成分處理和保存是非常關(guān)鍵的。本實(shí)驗(yàn)采
用冷凍干燥技術(shù)，應(yīng)用單因素及 Box-Behnken 響應(yīng)
面設(shè)計(jì)方法，對(duì)其活性組分凍干工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)
果表明，此優(yōu)化方法在保證獲得較好凍干率的基礎(chǔ)
上，能夠zui大程度地保留地龍?zhí)崛∥镉行С煞值幕?br />性，工藝穩(wěn)定可行，為地龍制劑研究及臨床應(yīng)用提
供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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