【導(dǎo)讀】 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類(lèi)似DNA分子的天然復(fù)制過(guò)程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增 2n 倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類(lèi)似DNA分子的天然復(fù)制過(guò)程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增 2n 倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

首先，你必須搞定PCR引物的設(shè)計(jì)

要先對(duì)PCR目的序列長(zhǎng)度要有大致估計(jì)：

*步：找到Primer3站點(diǎn)，你不用記住這個(gè)站點(diǎn)，但是要記住“Primer3”這個(gè)詞，然后打開(kāi)GOOGLE首頁(yè)，輸入Primer3，跳出來(lái)的*個(gè)項(xiàng)目就是了“Primer3 Input 0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”：http://frodo.wi.mit.edu          

第二步：貼上模板序列。進(jìn)入Primer3站點(diǎn)，可以看到一個(gè)引物設(shè)計(jì)的界面。（附件：Word文檔里有圖）在“Paste source sequence below(5'->3'…..”下面的大空框里將你的模板序列粘帖進(jìn)去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒(méi)關(guān)系，軟件會(huì)自動(dòng)過(guò)濾。

第三步：重要參數(shù)設(shè)定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個(gè)參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如：480～500，具體看情況調(diào)整。第二個(gè)參數(shù)是“Primer Size”，默認(rèn)值一般可以用，但是，當(dāng)你用熟了這個(gè)軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個(gè)參數(shù)是“PrimerTm”這個(gè)和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers：點(diǎn)一下這個(gè)按鈕，符合你大小預(yù)期的primer就出來(lái)了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來(lái)了，而且有primer在序列上的位置比對(duì)圖，還要primer本身的信息，包括：位置、長(zhǎng)度、Tm、GC含量、任何位置互補(bǔ)堿基數(shù)、3'端互補(bǔ)堿基數(shù)以及引物序列（注意：下游引物是5'->3'），還要看產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補(bǔ)堿基數(shù)，兩引物間3'端互補(bǔ)堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi)，但還不是*，將會(huì)給出警告。

第五步：引物設(shè)計(jì)檢驗(yàn)：可以僅設(shè)計(jì)一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個(gè)就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里（注意：下游引物書(shū)寫(xiě)反向仍然是5'->3'）如果符合設(shè)定條件，軟件將對(duì)給出引物評(píng)分，同時(shí)給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當(dāng)對(duì)自定義引物做些調(diào)整即可，警告信息也讓你做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候心中有數(shù)。對(duì)于文獻(xiàn)發(fā)表的引物，檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無(wú)意誤導(dǎo)。至于RT-PCR所用引物，使得產(chǎn)物跨過(guò)內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對(duì)RT-PCR干擾。實(shí)際做引物的時(shí)候，要把內(nèi)含子都去掉，僅將外顯子序列放入源序列框中，并且，通過(guò)自定義引物設(shè)計(jì)的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。

至于設(shè)計(jì)出來(lái)引物的實(shí)際效果，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，一般情況下都能做到PCR一次成功，也許隨便那一段序列做引物也能達(dá)到很好的效果，但是不管怎么說(shuō)，軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。

PCR實(shí)用技巧

增加PCR特異性：

1.primers design

這是zui重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：

1)足夠長(zhǎng)，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說(shuō)越長(zhǎng)越好，太長(zhǎng)的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；

2)GC%，40%~60%；

3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；

4)避免3'端GCrich，zui后3個(gè)base不要有GC，或者zui后5個(gè)有3個(gè)不要是GC（有人說(shuō)：3'端是GC/CG/CC/GG。)；

5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；

6)避免3'端的錯(cuò)配；

7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；

8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們；

9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；

10)學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，online design et al.

*primer的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的primer和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度，Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火。同時(shí)，還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比primer的Tm低5℃。

設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于：小于18堿基的primer。

有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定primerTmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基特性預(yù)測(cè)primer的雜交穩(wěn)定性，大部分計(jì)算器程序使用近鄰分析法。

根據(jù)所使用的公式及primer序列不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)?，大部分公式提供一個(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)。可以通過(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少primer二聚體和非特異性產(chǎn)物形成。

為獲得*結(jié)果，兩個(gè)primer應(yīng)具有近似的Tm值。primer對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)primer在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)primer Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃，或者，為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度*行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余循環(huán)。使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可獲得目的模板部分拷貝。

stability of primers：定制primer標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)足夠。

primer產(chǎn)量受合成化學(xué)效率及純化方法影響。定制primer以干粉形式運(yùn)輸。在TE重溶primer，使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)?，水的pH經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核甘的水解。primer的穩(wěn)定性依賴(lài)于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的primer儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的primer在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個(gè)月。

PCR操作時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)

PCR檢測(cè)微量感染因子時(shí)，容易因?yàn)槲廴镜亩鴮?dǎo)致各種問(wèn)題，因此，進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染出現(xiàn)。

（1）劃分操作區(qū)：

目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)*閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
①標(biāo)本處理區(qū)，包括：擴(kuò)增摸板制備；
②PCR擴(kuò)增區(qū)，包括：反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增；
③產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。
※各工作區(qū)要具有一定隔離，操作器材，要有一定方向性，如，標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

（2）分裝試劑：

PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝，所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源DNA：
①PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；
②引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；
③引物和d-NTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因；

（3）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。

因此：不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
①戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；
②使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
③避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
④操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的度；
⑤zui后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；
⑥操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；
⑦盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如，沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；
⑧重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

PCR擴(kuò)增重要標(biāo)準(zhǔn)

什么是PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度?

靈敏度指的是PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠檢測(cè)到目的基因zui小值。研究結(jié)果表明，影響PCR擴(kuò)增效率的因素，如，模板的復(fù)雜程度與完整性、引物純度及其與模板結(jié)合效率、反應(yīng)溫度、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴(kuò)增性能、反應(yīng)緩沖液的離子組成（主要指：陽(yáng)離子）、反應(yīng)優(yōu)化劑等，均決定PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靈敏度。在*擴(kuò)增條件下，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)到pg(10～12g)數(shù)量級(jí)目的基因。對(duì)于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系（包括：DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等）就是研究者提高PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度的關(guān)鍵因素了。
與實(shí)驗(yàn)室自配PCR擴(kuò)增體系相比，東盛Taq Mix對(duì)反應(yīng)緩沖液中的成分進(jìn)行優(yōu)化，并加入了適當(dāng)比例的反應(yīng)增強(qiáng)劑（PCR Enhancer），提高DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR擴(kuò)增性能影響，使得DNA聚合酶處于zui適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高檢測(cè)靈敏度。即時(shí)反應(yīng)體系中只有幾個(gè)目的基因拷貝，也能輕松檢測(cè)。

什么是PCR實(shí)驗(yàn)特異性？
特異性指的是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，專(zhuān)一性擴(kuò)增目的片段而非其他片段的性能。在PCR實(shí)驗(yàn)本身的靈敏度很高，且實(shí)驗(yàn)條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會(huì)在目的片段出現(xiàn)同時(shí)伴隨有其他雜帶，即，發(fā)生非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件控制等均會(huì)影響PCR擴(kuò)增特異性。近年，研究結(jié)果表明，緩沖液品質(zhì)（如，離子種類(lèi)與組成，反應(yīng)優(yōu)化劑等）對(duì)保證PCR特異性擴(kuò)增起著不可忽視的作用。一般緩沖液中調(diào)節(jié)氫鍵作用鹽只有KCl，而東盛HSTMTaq Mix的緩沖體系通過(guò)反應(yīng)優(yōu)化劑以及KCl/(NH₄)SO₄鹽離子體系平衡調(diào)節(jié)，顯著提高PCR擴(kuò)增特異性，降低背景。   

PCR實(shí)驗(yàn)靈敏度與特異性是一對(duì)此長(zhǎng)彼消特性，這也決定我們實(shí)驗(yàn)體系調(diào)節(jié)實(shí)際上就是需要找到適合實(shí)驗(yàn)靈敏度與特異性平衡點(diǎn)。由于PCR體系中的眾多成分，使得組合較多，篩選工作繁雜。東盛基于靈敏度與特異性分別設(shè)計(jì)了PCR Mix和HS Taq Mix，幫您確定大平衡點(diǎn)，如果您需要更細(xì)致的平衡點(diǎn)，請(qǐng)選擇相應(yīng)的Mix Kit系列進(jìn)行微調(diào)。