鎖相放大器用于生物樣品雙通道和多儀器模式SRS顯微技術(shù)的研究

本文由昊量光電翻譯整理，文章內(nèi)容由華盛頓大學(xué)化學(xué)系的 Brian Wong 和 Dan Fu 提供，并由Liquid公司提供原文。

一．簡介 

拉曼散射光譜為生物分子的特異性檢測和分析提供了化學(xué)鍵的固有振動指紋。那么什么是受激拉曼散射顯微鏡？受激拉曼散射(SRS)顯微技術(shù)是一種相對較新的顯微技術(shù)，是一種相干拉曼散射過程，允許使用光譜和空間信息進(jìn)行化學(xué)成像[18]，由于相干受激發(fā)射過程[1]能產(chǎn)生約103-105倍的增強(qiáng)拉曼信號，可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)視頻速率(約25幀/s)[2]的高速成像。SRS顯微鏡繼承了自發(fā)拉曼光譜的優(yōu)點(diǎn), 是一種能夠快速開發(fā)、label-free的成像技術(shù)，同時具有高靈敏度和化學(xué)特異性[3-6], 在許多生物醫(yī)學(xué)研究的分支顯示出應(yīng)用潛力,包括細(xì)胞生物學(xué)、脂質(zhì)代謝、微生物學(xué)、腫瘤檢測、蛋白質(zhì)錯誤折疊和制藥[7-11]。特別的是，SRS在對新鮮手術(shù)組織和術(shù)中診斷的快速組織病理學(xué)方面表現(xiàn)出色，與傳統(tǒng)的H&E染色幾乎wan全一致[12,13]。此外，SRS能夠根據(jù)每個物種的光譜信息，對多種組分的混合物進(jìn)行定量化學(xué)分析[6,7,14]。

盡管在之前的研究[17]中已經(jīng)研究了痛風(fēng)中MSU的自發(fā)拉曼光譜，但微弱的信號強(qiáng)度阻礙了其用于快速組織學(xué)的應(yīng)用。因此，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院華英匯教授 和復(fù)旦大學(xué)物理學(xué)系季敏標(biāo)教授團(tuán)隊(duì)將受激拉曼散射顯微技術(shù)用于人體痛風(fēng)組織病理成像[15]。研究人員應(yīng)用SRS和二次諧波（SHG）顯微鏡同時表征了晶型和非晶型MSU。在普通光鏡下，MSU晶體呈典型的針狀。這些晶體在拉曼峰630 cm-1的SRS上很容易成像，當(dāng)SRS頻率稍微偏離振動共振時，表現(xiàn)出了高化學(xué)特異性的非共振行為，SRS信號消失。已知SHG對非中心對稱結(jié)構(gòu)敏感，包括MSU晶體和[17]組織中的膠原纖維。然而，由于拉曼極化率張量和二階光學(xué)磁化率對晶體對稱性[16]的依賴，研究者們發(fā)現(xiàn)線偏振光光束在晶體取向上傾向于產(chǎn)生SRS和SHG的強(qiáng)各向異性信號。因此，研究者們對泵浦光束和斯托克斯光束都應(yīng)用了圓偏振，以消除MSU晶體和膠原纖維的定向效應(yīng)。

Moku:Pro 的鎖相放大器 (LIA) 為受激拉曼散射 (SRS) 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中的自外差信號檢測提供了一種直觀、精確且穩(wěn)健的解決方案。高質(zhì)量的 LIA 是 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中具有調(diào)制傳輸檢測方案的關(guān)鍵硬件組件。在此更新的案例研究中，我們提供了有關(guān)雙 LIA 應(yīng)用程序的更多詳細(xì)信息和描述。

由于SRS 是一種相干拉曼散射過程，允許使用光譜和空間信息進(jìn)行化學(xué)成像[18]。它使用兩個同步脈沖激光器，即泵浦和斯托克斯（圖 1）相干地激發(fā)分子的振動。當(dāng)入射到樣品上的兩束激光的頻率差與目標(biāo)分子的振動頻率相匹配時，就會發(fā)生 SRS 過程。振動激發(fā)的結(jié)果是泵浦光束將失去光子，而斯托克斯光束將獲得光子。當(dāng)檢測到泵浦光束的損失時，這稱為受激拉曼損失 (SRL) 檢測。強(qiáng)度損失 ΔI?/I? 通常約為 10 -7 -10 -4，遠(yuǎn)小于典型的激光強(qiáng)度波動。為了克服這一挑戰(zhàn)，需要一種高頻調(diào)制和相敏檢測方案來從嘈雜的背景中提取 SRS 信號[19]。在 SRL 檢測方案中，斯托克斯光束以固定頻率調(diào)制，由此產(chǎn)生的調(diào)制傳輸?shù)奖闷止馐?LIA 檢測。

圖 1：受激拉曼損耗檢測方案。檢測到由于 SRS 引起的 Stokes 到泵浦光束的調(diào)幅傳輸。演示的泵浦光束具有 80 MHz 的重復(fù)率，Stokes 光束具有相同的 80 MHz 重復(fù)率，但也以 20 MHz 進(jìn)行調(diào)制。Δpump 是 LIA 在此檢測方案中提取的內(nèi)容

二．實(shí)驗(yàn)裝置

 使用的激光系統(tǒng)能夠輸出兩個 80 MHz 的激光脈沖序列：斯托克斯光束在 1030 nm，泵浦光束在 790 nm。激光輸出也用于同步調(diào)制：80 MHz 參考被發(fā)送到分頻器以生成 20 MHz TTL 輸出。這些 20 MHz 輸出被使用兩次：一次作為電光調(diào)制器調(diào)制斯托克斯光束的驅(qū)動頻率，另一次作為外部鎖相環(huán)的 LIA 輸入通道 2（B 中）的參考。泵浦光束由硅光電二極管檢測，然后被發(fā)送到 LIA 的輸入通道 1（In A）。來自輸出通道 1（Out A）的信號被發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡以進(jìn)行圖像采集。來自輸出通道 2 (Out B) 的信號被最小化（通過調(diào)整相移）。

2.1 單通道鎖相放大器配置

圖 2：典型的鎖定放大器配置設(shè)置

圖 2 演示了用于 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)的 LIA 的初始設(shè)置。在初始設(shè)置時，必須重新獲取鎖相環(huán)。輸入均配置為 AC：50 歐姆。通過調(diào)整相位度數(shù)優(yōu)化相移 (Df)，直到 Out A zui大化（正值）并且 Out B 最小化（接近零）。探針A顯示對應(yīng)于 DMSO 最高信號峰 (2913 cm-1 ) 的 SRS 信號，并zui大化輸出 A 的 103.3 mV。探針B表示正交輸出，最小化為零。一旦 LIA 針對校準(zhǔn)溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，樣品就可以進(jìn)行成像了。

圖 3：2930 cm -1拉曼躍遷處的 SRS HeLa 細(xì)胞圖像

圖 3 是使用 Moku:Pro 鎖相放大器拍攝的 HeLa 細(xì)胞圖像。顯示的圖像是從 SRS 圖像生成的，拉曼位移為 2930cm-1，對應(yīng)于蛋白質(zhì)峰。低通濾波器設(shè)置為 40 kHz，對應(yīng)于 約4µs 的時間常數(shù)?？梢愿鶕?jù)SRS信號大小增加或減少增益。

2.2 雙通道成像

Moku:Pro 的 LIA 也適用于實(shí)時雙色 SRS 成像。這是通過在 SRS 成像中應(yīng)用正交調(diào)制并檢測LIA的X和Y輸出來執(zhí)行的。在這種情況下，斯托克斯調(diào)制有兩個部分：一個 20 MHz 脈沖序列生成SRS信號，另一個 20 MHz 脈沖序列具有90°相移，生成另一個針對不同拉曼波段的SRS信號[3]。由于90°相移，兩個通道（Out A和Out B）彼此正交，可以同時獲取兩個SRS圖像而不會受到干擾。

圖 4：使用正交調(diào)制和輸出在兩個不同的拉曼躍遷下同時獲得鼠腦樣本的雙通道 SRS 圖像

圖 4 是利用雙通道X&Y輸出同時在2930 cm -1和 2850 cm -1處生成兩個 SRS 圖像的代表性圖像。

2.3 多儀器模式應(yīng)用

 在大多數(shù) SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)中，由于激光器總帶寬的限制，光譜范圍被限制在大約 300 cm -1左右。繞過這一技術(shù)障礙的一種方法是使用可調(diào)諧激光器掃描波長。然而，波長調(diào)諧速度很慢，而且對于時間敏感的實(shí)驗(yàn)（如活細(xì)胞成像）來說往往不夠。應(yīng)對這一挑戰(zhàn)的另一種解決方案是引入第三束激光束來掃描不同的拉曼過渡區(qū)域。這種能力對于兩個光譜區(qū)域的同時成像特別有吸引力：一個在指紋區(qū)域（例如 約1600 cm-1用于酰胺振動）和一個在CH區(qū)域（例如 約2900 cm -1蛋白質(zhì)）。在 SRL 成像方法中，實(shí)驗(yàn)裝置由一個斯托克斯光束和兩個不同波長的泵浦光束組成。此設(shè)置的常用檢測方法需要單獨(dú)的檢測器和單獨(dú)的 LIA。然而，Moku:Pro 的多儀器模式允許部署多個LIA，因此可以在不需要任何額外硬件妥協(xié)的情況下實(shí)施第二個LIA。

圖 5：Moku:Pro 多儀器鎖相放大器配置

圖 5 演示了LIA 的多儀器模式設(shè)置，用于同步 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)。對于Slot 1，In 1是第一個光電二極管的檢測信號，In 2是參考信號，Out 1是發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡的信號，Out 3被丟棄。對于 Slot 2，In 3 是第二個光電二極管的檢測信號，In 2 再次作為參考，Out 2 是發(fā)送到數(shù)據(jù)采集卡的信號，Out 4 被丟棄。此配置僅使用 4 個 Moku 插槽中的 2 個。插槽 3 和 4 未分配，因此可用于進(jìn)一步的 LIA 或任何其他 Moku 儀器。輸入全部配置為 AC：50 歐姆。每個 LIA 插槽（1 和 2）都遵循與單通道 LIA 配置相同的設(shè)置。

在三個激光器的情況下，Moku:Pro 的多儀器模式可以配置兩個鎖定放大器，將系統(tǒng)簡化為一個設(shè)備，而不會有任何妥協(xié)。這使得研究人員可以同時拍攝兩張波數(shù)差較大的 SRS 圖像，利用一個 Moku:Pro 來處理兩個光電二極管檢測器信號。

圖 6：HeLa 細(xì)胞 SRS 圖像使用多儀器設(shè)置在間隔較遠(yuǎn)的拉曼躍遷處拍攝

圖 6 是利用一個Moku:Pro處理兩個光電二極管檢測器信號同時拍攝兩個大波數(shù)差的 SRS 圖像的代表性圖像。

三．結(jié)論

 Moku:Pro 的 LIA 為大量 SRS 顯微鏡實(shí)驗(yàn)提供了出色的解決方案。在本文檔中，討論了典型的單通道 SRS 成像、雙通道成像和多儀器成像。用戶界面允許對提取低強(qiáng)度 SRS 信號進(jìn)行直觀和強(qiáng)大的控制。重要的是 Moku:Pro 的多儀器工具功能允許在多儀器同用的緊湊型系統(tǒng)上進(jìn)行復(fù)雜的成像實(shí)驗(yàn)。

圖 7：Moku:Pro 在多樂器模式下的使用圖像。In 1 和 In 3 分別是插槽 1 和插槽 2 中 LIA 的信號輸入。2 中是兩個 LIA 插槽的參考。在所示的配置中，Out 1 和 Out 3 是記錄的信號，Out 2 和 Out 4 是插槽 1 和 2 的轉(zhuǎn)儲信號

參考文獻(xiàn)：

1.Freudiger CW, Min W, Saar BG, Lu S, Holtom GR, He C. et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 2008;322:1857-61

2.Saar BG, Freudiger CW, Reichman J, Stanley CM, Holtom GR, Xie XS. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 2010;330:1368-70

3.Ji M, Lewis S, Camelo-Piragua S, Ramkissoon SH, Snuderl M, Venneti S. et al. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 2015;7:309ra163

4.Ji M, Arbel M, Zhang L, Freudiger CW, Hou SS, Lin D. et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer''s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Adv. 2018;4:eaat7715

5.Cheng JX, Xie XS. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 2015;350:aaa8870

6.Ao JP, Feng YQ, Wu SM, Wang T, Ling JW, Zhang LW. et al. Rapid, 3D Chemical Profiling of Individual Atmospheric Aerosols with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Small Methods. 2020;4:1900600

7.Hu F, Shi L, Min W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 2019;16:830-42

8.Fu D, Zhou J, Zhu WS, Manley PW, Wang YK, Hood T. et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nat Chem. 2014;6:614-22

9.Shen Y, Zhao Z, Zhang L, Shi L, Shahriar S, Chan RB. et al. Metabolic activity induces membrane phase separation in endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114:13394-9

10.Bae K, Zheng W, Ma Y, Huang Z. Real-time monitoring of pharmacokinetics of antibiotics in biofilms with Raman-tagged hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Theranostics. 2019;9:1348-57

11.Shin KS, Laohajaratsang M, Men S, Figueroa B, Dintzis SM, Fu D. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 2020;10:5865-78

12.Ji M, Orringer DA, Freudiger CW, Ramkissoon S, Liu X, Lau D. et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 2013;5:201ra119

13.Orringer DA, Pandian B, Niknafs YS, Hollon TC, Boyle J, Lewis S. et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nat Biomed Eng. 2017;1:0027

14.He R, Liu Z, Xu Y, Huang W, Ma H, Ji M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Opt Lett. 2017;42:659-62

15.Li B, Singer NG, Yeni YN, Haggins DG, Barnboym E, Oravec D. et al. A point-of-care Raman spectroscopy-based device for the diagnosis of gout and peudogout: comparison with the clinical standard microscopy. Arthritis Rheum. 2016;68:1751-7

16.Zhang B, Xu H, Chen J, Zhu X, Xue Y, Yang Y, Ao J, Hua Y, Ji M. Highly specific and label-free histological identification of microcrystals in fresh human gout tissues with stimulated Raman scattering. Theranostics 2021; 11(7):3074-3088

17.Streets AM, Li A, Chen T, Huang Y. Imaging without fluorescence: nonlinear optical microscopy for quantitative cellular imaging. Anal Chem. 2014;86:8506-13

18.Freudiger, W.; Min, W.; Saar, B. G.; Lu, S.; Holtom, G. R.; He, C.; Tsai, J. C.; Kang, J. X.; Xie, X. S., Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science 2008, 322 (5909), 1857-1861.

19.Hill, H.; Fu, D., Cellular Imaging Using Stimulated Raman Scattering Microscopy. Anal. Chem. 2019, 91 (15), 9333-9342.

20.Figueroa, ; Hu, R.; Rayner, S. G.; Zheng, Y.; Fu, D., Real-Time Microscale Temperature Imaging by Stimulated Raman Scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters 2020, 11 (17), 7083-7089.

更多詳情請聯(lián)系昊量光電/歡迎直接聯(lián)系昊量光電

關(guān)于昊量光電：

上海昊量光電設(shè)備有限公司是光電產(chǎn)品專 業(yè)代理商，產(chǎn)品包括各類激光器、光電調(diào)制器、光學(xué)測量設(shè)備、光學(xué)元件等，涉及應(yīng)用涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫(yī)療、科學(xué)研究、國 防、量 子光學(xué)、生物顯微、物聯(lián)傳感、激光制造等；可為客戶提 供完 整的設(shè)備安裝，培訓(xùn)，硬件開發(fā)，軟件開發(fā)，系統(tǒng)集成等服務(wù)。