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全自動酶標儀：全自動酶標儀正確運用方法
閱讀：3907 發(fā)布時間：2018-1-29
作為微孔板比色計的酶標儀，其底子功用不外乎一個比色測定，所紛歧樣的是在測定波長規(guī)模、吸光度規(guī)模、光學體系、檢測速度、震板功用、溫度操控、定性和定量測定軟件功用等方面的差異，當然全主動酶免疫剖析體系還具有主動洗板、溫育、加樣等功用。
在臨床試驗室實踐作業(yè)中，試驗人員在運用酶標儀進行測定操作時，有時不免會對酶標儀的一些功能指標發(fā)作利誘，甚至對酶標儀的運用發(fā)作過錯的知道。如比如運用酶標儀較用肉眼調(diào)查測定的陽性率顯著增加這樣的疑問。
1、測定波長：通常酶標儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，*可以滿意ELISA的顯色測定。當前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所運用的符號用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存鄙人，經(jīng)HRP作用，別離氧化為2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當pH值為5.0左右時，DAB在450nm波利益有zui大吸收，當pH值降為L 0時，zui大吸收波長移至492 nm，一起摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸停止反響。TMB的氧化產(chǎn)品聯(lián)苯醌在波長450nm處有zui大消光系數(shù)，若是HRP量少，H：O：和TMB過量時，則構(gòu)成藍色的陽離子根。下降pH，即可使藍色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，運用硫酸作為停止劑可使產(chǎn)品安穩(wěn)90min。因而，450nm和492 nm兩個波長是當前ELISA測定zui常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可主動變換的部件，可以一起裝置6～8片濾光片，所裝備的濾光片均應包含上述兩個波長，有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。除了這兩個底子濾光片外，考慮到雙波長比色的需求，還應有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可依據(jù)自個的需求挑選。有時，有的試驗室期望用酶標儀作微量生化測定，故酶標儀出產(chǎn)廠家對其出產(chǎn)的酶標儀拓展了紫外檢測功用，此刻需求一個340 nm波長濾光片。此刻，酶標儀的測定波長規(guī)模就變成340—750nm或800nm。
酶標儀有單波長和雙波長檢測功用有時運用者不知在啥情況下運用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”即是運用一種對顯色具zui大吸收的波長即450 nm或492 nm進行比色測定;而“雙波長”則除了用對顯色具zui大吸收的波長即450 nm或492 nm進行比色測定外，一起用對特異顯色不靈敏的波長如630 nm進行測定，酶標儀zui終打印出來的吸光度則為二者之差。630 nm波長下得到的吸光度對錯特異的，來自于板孑L上比如指紋、塵埃、臟物等所形成的的吸收。因而，在ELISA比色測定中，*運用雙波長，且不用設空白孔。
2、測定的吸光度規(guī)模：通常，酶標儀的吸光度測定規(guī)模在。一2.5之間即可以滿意ELISA的測定需求。前期的酶標儀可測定的吸光度通常在。一2.5之間，但現(xiàn)在底子上都做了拓展，可到達3.5以上，并且能堅持精細度與線性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK—2的吸光度測定規(guī)模為0—3.5，而Multiskan Ascent的吸光度測定規(guī)模(Abs)達0～4.0，在0～4.0規(guī)模，線性差錯不超越±2.0%，在0.3—3.0吸光度規(guī)模內(nèi)，測定精細度CV小于±0.2%;3.0～4.0Abs規(guī)模內(nèi)，測定精細度CV小于士0.2%。因而，關于酶標儀的吸光度規(guī)模不用去故意追求大的吸光度規(guī)模，首要要看在必定的吸光度規(guī)模內(nèi)的線性和精細度怎么。
3、光學體系：酶標儀的光學體系選用的是筆直光路多通道(通常為8或12通道，亦有單通道)檢測，通常為硅光管或光導纖維，除測定通道外，有的酶標儀還有一個參比通道，每次測定可進行自我校準。酶標儀的光學體系功用怎么，均可經(jīng)過酶標儀測定的吸光度規(guī)模、線性度、精細度和度等表現(xiàn)出來。光學體系好的話，則上述方針也應較佳。測定的精細度與測定通道之間的均一性有直接關系。單通道可防止因通道紛歧樣所形成的的差異。
4、檢測速度：酶標儀的檢測速度是指其完結(jié)比色測定所需求的時刻。檢測速度快，有利于進步檢測的精細度，即防止因為測定進程中，因測守時刻紛歧樣所形成的的各微孔間吸光度間的差異。當前市場上常見的酶標儀檢測速度都非?？?，通常在數(shù)秒鐘內(nèi)，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK—3檢測96孔只需2s(接連形式)或5s(步進形式)。Multiskan Ascent為單通道檢測，亦只需9s(接連形式)或14s(步進形式)。又如BioRad公司的Benchmark的檢測速度單波長為7s，雙波長為15s。
5、震板功用：酶標儀的震板功用是指酶標儀在對ELISA板孔進行比色測定前對其進行振動混勻，使板孔內(nèi)色彩均一。當前市場上常見的酶標儀均有震板功用，所紛歧樣的是震板方法，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方法及振動起伏等恣意調(diào)理，如Labsystems的MK-2;有的則較為固定，如BioRad 550。運用有震板功用的酶標儀，在進行ELISA測定顯色反響完結(jié)參加停止劑后，可不用振動混勻，直接放人酶標儀上測定即可。
6、溫育功用：溫育功用是指酶標儀自身能按需求主動地操控儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測定中微孔板條的溫育進程可在儀器內(nèi)部完結(jié)，而無需再外配溫箱。當前，只要少部分酶標儀具有此種功用，如Labsystems公司的Multiskan Ascent，BioRad公司的Benchmark和Biotek公司的ElxS08等。溫育功用僅僅酶標儀的一個附加功用，是不是具有并不能闡明酶標儀層次的凹凸及儀器的好壞。作為試驗室是不是挑選，則可依據(jù)自個試驗室的條件及需求來決議。
7、軟件功用：軟件功用是指酶標儀所具有的對ELISA定性和定量測定及其他測定方法如酶標動力學、紫外和凝聚等數(shù)據(jù)的核算剖析并陳述成果的功用。軟件功用是中酶標儀的一個非常重要的功用。若是硬件方面差異不大，則軟件就變成斷定酶標儀好壞的專一方針。關于用戶來說，好的軟件功用，對實踐作業(yè)會有較大的協(xié)助。ELISA定性測定，酶標儀如具有陽性判別值(cut-off)及其測定“灰區(qū)”(即指測定吸光度處于cut—off周圍的必定區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)成果應為“可疑”)的核算核算功用，不光方便了試驗室作業(yè)人員，并且在某些特定的情況下，有很高的實用價值。如血站試驗室為篩檢獻血員血進行HBsAg、抗HCV和抗HIV等的ELISA測守時，常會遇到測定吸光度處于cut-off鄰近但又低于cut—off的血，依照試劑盒的規(guī)范，可判為陰性，血為合格血，可用于患者輸血，但直覺通知咱們，這樣的血如輸給患者，致使輸血后相應疾病發(fā)作的能夠性較大，這是由ELISA現(xiàn)有的測定技能的不斷定性所形成的，也即是ELISA測定的“灰區(qū)”的存在使得ELISA測定試劑盒cut-off的設定僅僅相對的，此刻的假陽性和假陰性呈現(xiàn)的能夠性較低。因而，在血站篩檢獻血員血時，如以測定“灰區(qū)”的下限作為判別獻血員血篩檢不合格規(guī)范，就可以防止因“灰區(qū)”所形成的成果判別過錯而導致輸血后疾病發(fā)作的能夠性。適宜的軟件功用關于ELISA定量測定相同很重要。有研討標明，四參數(shù)方程能較好地反映免疫測定的劑量反響曲線，zui為合適于定量酶免疫測定的曲線擬合。因而，如意圖是定量測定，則在酶標儀的軟件功用中，*要有這種曲線回歸方程核算剖析功用。其他比如連點、直線等回歸核算，則可依據(jù)酶標儀的運用意圖而定，如兼用于微量生化測定，則此類回歸核算就很有必要。
:此外，酶標儀兼做酶標動力學、凝聚反響測定所需的軟件是不是應具有，當然也應依據(jù)運用意圖而定。因為此類軟件通常都較為貴重，酶標儀常別的獨自按需裝備，若是不是試驗室特殊需求，就不用強求這種軟件功用。
8、言語界面 通常進口的中酶標儀人機對話多選用英文。這關于某些底層試驗室能夠會存在言語方面的艱難，然后難以zui大極限地發(fā)揚酶標儀的作用。為處理這方面的疑問，已有一些酶標儀選用了中文界面，如Labsystems的MK-3。這樣就大大方便了廣闊底層試驗室技能人員的運用。
綜上所述，雖然酶標儀的開展極為疾速，種類繁復，功用也不斷加強，但其zui底子的功用是不變的，即比色測定。大凡比色測定，其底子需求即是在必定吸光度規(guī)模內(nèi)要有好的測定性、線性和精細性。相同的吸光度規(guī)模，測定的性、線性和精細性越好則酶標儀亦越佳。并且，因為用于酶標儀比色測定的為多孔(通常為96孔)微孑L板條，為確保測定的孔間重復性，則測定速度也是一個較重要的功能方針。至于其他如震板、溫育及有關的軟件功用，則可依據(jù)各自試驗室的需求去對比挑選。
