Sia Rich a2,3-特異性色譜柱親和色譜分離指南

SiaFind α2,3-特異性Lectenz 是一種唾液酸親和試劑，用于檢測(cè)、分離和富集終止于Neu5Acα2,3Gal的唾液聚糖，常見(jiàn)于糖綴合物（糖蛋白、糖脂和低聚或多糖）。它對(duì)聚糖上的α2，3連接的唾液酸具有高親和力和特異性。但是，它不綁定有效地與支鏈唾液酸化表位如唾液酸化Lewis A/X結(jié)合。該試劑可用作各種應(yīng)用。

SiaRich α2,3-特異性柱（Cat#SC2301）是SiaFind α2，3-特異性L(fǎng)ectenz 偶聯(lián)柱，用于通過(guò)親和色譜法快速富集和純化α2，3連接的唾液聚糖結(jié)合物。特異性結(jié)合的唾液酸化糖蛋白或其他生物分子可以競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性地從柱洗脫。

對(duì)于HEK細(xì)胞中表達(dá)的Robo1-GFP，使用SiaRich α2,3-特異性色譜柱，富集了α2,3-連接的唾液酸化糖型。使用生物素標(biāo)記的SiaFind α2,3-特異性Lectenz 作為主要探針，通過(guò)Western印跡法檢測(cè)確認(rèn)了富集的效果。

Sia Rich a2,3-特異性色譜柱形式和存儲(chǔ)：

SiaRich 親和柱已預(yù)包裝并準(zhǔn)備好FPLC。它在SiaFind 結(jié)合緩沖液3（SBB3；25mM EPPS，110mM NaCl，pH 7.5）中提供。自生產(chǎn)之日起，它在4°C下穩(wěn)定三個(gè)月。切勿凍結(jié)柱。

所有5X緩沖液應(yīng)使用超純水稀釋至1X。例如，為了制備250 mL，將50 mL任何5X緩沖液加入200 mL水中，并通過(guò)倒置混合。所有緩沖器可儲(chǔ)存在4至25°C的溫度下。

如何使用SiaRich α2,3-Specific Column進(jìn)行親和色譜分離？

1. 準(zhǔn)備緩沖液：使用5倍濃縮的結(jié)合緩沖液（產(chǎn)品編號(hào)BA0103）制備1X SiaFind 結(jié)合緩沖液3，以及使用5倍濃縮的再生緩沖液（產(chǎn)品編號(hào)BA0301）制備1X SiaFind 再生緩沖液1。

2. 平衡柱：以1 mL/min的速度用5 mL的SBB3平衡柱。

3. 注射樣品：以0.5 mL/min的速度注射待分析物。s次運(yùn)行推薦使用400 μg的胎蛋白（fetuin）溶于1 mL SBB3。

4. 洗脫柱：以1 mL/min的速度用10 mL的SBB3洗脫柱。

5. 洗脫結(jié)合的分析物：非競(jìng)爭(zhēng)性地用5 mL的SRB1洗脫，或競(jìng)爭(zhēng)性地用5 mL的50 mM 3'-唾液乳糖（溶于SBB3）洗脫，速度為1 mL/min。

注意：3'-唾液乳糖中的雜質(zhì)可能導(dǎo)致280 nm處顯著吸收，人為增加洗脫峰。

6. 再生柱：用5 mL的SRB1以1 mL/min的速度再生柱。

7. 重復(fù)步驟1：為下一次運(yùn)行或短期存儲(chǔ)柱子做準(zhǔn)備。

8. 長(zhǎng)期存儲(chǔ)：可選步驟，用含有20%乙醇的5 mL SBB3（5X SBB3:H2O:乙醇的1:3:1混合物）填充柱子。

9. 柱子的重復(fù)使用：直到洗脫峰中包含的胎蛋白少于注射的400 μg時(shí)，柱子可以重復(fù)使用。

10. 注意事項(xiàng)：

對(duì)于復(fù)雜樣品（如細(xì)胞提取物），可能需要以更慢的流速注射以z大化結(jié)合。

濃縮樣品必須在SBB3中充分稀釋以確保與柱子的最佳結(jié)合。

進(jìn)行下游分析，如使用SiaFind α2,3-Specific Lectenz 進(jìn)行西方印跡（Western Blot），以確認(rèn)α2,3-連接的唾液酸糖綴合物的富集。