永生化細胞的工作流程及質量控制考慮

細胞永生化是癌變的必經(jīng)途徑，通過人為干涉如放射處理、端粒酶激活、病毒基因轉染等方法實現(xiàn)。永生化細胞具有科研價值，如作為研究細胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，節(jié)省分離細胞的周期和成本，是研究腫瘤發(fā)生機制的重要模型，并可建立穩(wěn)定細胞庫提供一致且可重復的實驗結果。

基本的細胞系永生化工作流程：

細胞永生化的方法：

細胞自發(fā)永生化的幾率非常小，于人類細胞就更為罕見。

人為干涉讓細胞永生化的方法包括：放射處理、端粒酶激活、病毒基因轉染、原癌基因激活、抑癌基因抑制等。其中，聽過慢病毒感染使細胞過表達猴腎病毒SV40 T抗原或人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因，是Z常用的兩種細胞永生化的方法。

方法A：端粒酶逆轉錄酶蛋白（TERT）表達

TERT蛋白是端粒酶的催化亞基，在大多數(shù)體細胞中通常不活躍。在這種方法中，您可以將編碼人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感興趣的原代細胞中。當hTERT被外源性表達時，細胞能夠維持足夠的端粒長度以避免衰老。這是最近開發(fā)用于細胞永生化的方法。

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通過抑制腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）來實現(xiàn)永生化。這種方法比方法A更快地生效，但可能會改變一些細胞的特性。

在許多情況下，單獨使用方法A和B可能不足以成功實現(xiàn)永生化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，共同表達hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并產(chǎn)生更真實和正常的細胞模型，具有明確定義的遺傳背景。

艾美捷永生化細胞的常見方法：

試劑 機制 ABM可提供的形式

SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Ras Suppression of Rb Lentivirus

C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus

Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus

HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

EBV Viral oncogene -

hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

細胞系質量控制考慮

太好了！在這個階段，您已經(jīng)生成了一個永生化細胞系。但是，在您開始在項目中使用您的細胞系之前，有一些重要的質量控制檢查您可以進行，以確保您的細胞系處于wan美狀態(tài)。

A.您的細胞系表征

每次永生化后，您應該始終檢查您的細胞是否具有適當?shù)臉擞?，以及細胞的功能，以確保它代表您所使用的原代細胞。當您研究細胞途徑時，這一步尤為重要，因為您不希望永生化步驟改變了特定途徑、功能或細胞的表型。 例如，如果您計劃使用您的細胞進行細胞毒性測定，那么使用您的永生化細胞與原代細胞一起進行細胞毒性測定是個好主意，以確保您新永生化的細胞對刺激的反應與它們的原始細胞相似。

B.傳代和轉基因表達測試

將您的細胞傳代至少30次，以證明轉基因已穩(wěn)定表達，并觀察它們的生長速度已提高，密度能力已增加。

C.STR分析

正如本文開頭提到的，驗證您的細胞系身份至關重要，因為可能會發(fā)生交叉污染或種群混合的問題。例如，根據(jù)《科學》雜志上發(fā)表的一篇論文，廣泛用于實驗室的著名HeLa細胞被發(fā)現(xiàn)污染了許多細胞系，包括Hep-2和INT407細胞系。

識別細胞系的黃金標準是短串聯(lián)重復（STR）分析。STR分析是一種方法，其中在特定位點的短串聯(lián)DNA重復與標準參考配置文件進行比較。細胞系的STR分析可以用來確認其身份，定期進行STR分析是個好主意，以確保您的細胞系沒有隨著時間的推移受到污染。

為了應對細胞系誤識別事件，資助機構如NIH現(xiàn)在要求在資助申請中使用的細胞系進行STR分析，許多期刊也開始鼓勵這個關鍵的質量控制檢查。

D.支原體和病原體檢測

最后，始終測試微生物污染物，如真菌、細菌和支原體是個好主意。特別是支原體，是細胞培養(yǎng)實驗室中Z常見的污染物之一。通常很難通過顯微鏡下的視覺檢查來檢測支原體。然而，這種細菌可以影響細胞的增殖，改變其基因表達譜，并可能扭曲您的實驗結果。有許多試劑盒可用，例如abm的PCR支原體檢測和清除試劑盒，可以輕松檢測并清除50多種類型的支原體。