DNA Shuffling試劑盒的隨機突變&試驗準備

Jena Bioscience-DNA Shuffling試劑盒提供了每種技術所需的所有組件，并配有簡化的文檔，以Z大限度地提高成功率。

艾美捷DNA Shuffling試劑盒 #PP-103組分：

DNase I（黃色瓶蓋）：0.1單位/微升，100微升

消化緩沖液（藍色瓶蓋）：10倍濃度，100微升

DNase終止溶液（黃色瓶蓋）：100微升

Taq聚合酶（紅色瓶蓋）：5單位/微升，40微升

洗牌緩沖液（綠色瓶蓋）：10倍濃度，200微升

dNTP混合物（白色瓶蓋）：每種dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）10 mM，40微升

PCR級水（白色瓶蓋）：3乘以1毫升

DNA Shuffling的隨機突變

DNA Shuffling是一種體外定向進化蛋白質的強大技術。它通過重組來自一個或多個相關基因的基因片段來產(chǎn)生結構多樣性。

DNA Shuffling可以分為單基因Shuffling和多基因Shuffling。在單基因Shuffling中，只有一個基因被消化，隨后重新組裝，導致點突變的發(fā)生率約為0.7%。

DNA Shuffling在蛋白質進化中的主要應用是多基因Shuffling（通常稱為分子育種）。在這項技術中，多個同源DNA序列被消化，隨后重新組裝。結果是包含額外點突變的嵌合基因庫。

DNA Shuffling中的關鍵步驟是對感興趣的基因進行消化，以產(chǎn)生合適大小的片段。因此，試劑盒中的所有試劑都經(jīng)過優(yōu)化，以便在方便的時間框架內獲得所需大小的片段。

通常，使用平均大小為70-280 bp的片段會獲得最佳結果。請注意，DNase I消化會產(chǎn)生非常短的片段，這些片段無法通過后續(xù)的PCR進行擴增。

推薦試驗準備：

目標基因的DNase I消化

對于總體積為50微升的反應，使用5微升10倍消化緩沖液在一個合適的管中，并添加0.5-2微克的起始DNA

添加PCR級水至最終體積為50微升

每微克起始DNA添加0.1單位（1.0微升）的DNase I

根據(jù)所需的片段大小，在37°C下孵化最多8分鐘（參見圖2）

通過添加5微升DNase終止溶液來中止消化，然后在75°C下加熱滅活DNase I 10分鐘。

通過瓊脂糖凝膠電泳分離所需大小范圍的片段，并使用標準程序進行純化。

第一輪PCR（無引物）：

對于50微升的反應，取5微升10倍洗牌緩沖液在一個合適的管中，并添加來自步驟1的純化DNA片段至最終濃度為10-20納克/微升

添加1微升dNTP混合物

添加2.5單位（0.5微升）的Taq聚合酶

添加PCR級水至最終體積為50微升

推薦的熱循環(huán)條件：

變性：94°C 90秒

退火：55°C 30秒

延伸：72°C 30秒

循環(huán)次數(shù)：30-45

使用標準程序純化PCR產(chǎn)物

第二輪PCR（有引物）：

對于50微升的反應，取5微升10倍洗牌緩沖液，并添加2微升來自步驟2的PCR產(chǎn)物

添加1微升dNTP混合物

添加引物至最終濃度為0.8微摩爾/升

添加2.5單位（0.5微升）的Taq聚合酶

添加PCR級水至最終體積為50微升

推薦的熱循環(huán)條件：

變性：94°C 30秒

退火：55°C 30秒

延伸：72°C 30秒

循環(huán)次數(shù)：15

DNA Shuffling試劑盒相關產(chǎn)品：

NU-1005, dNTP Bundle

NU-1008, dUTP - 溶液

NU-408, ATPαS

PR-103, GGTase-II（RabGGTase）

AB-102, 諾索鏈菌素 - 粉末

NU-1010-SOL, ATP - 溶液

NU-1012-SOL, GTP - 溶液

NU-1018, ddTTP

NU-426, dATPαS

PP-101, JBS dNTP突變試劑盒