CUT&RUN試劑盒丨高富集度CUT&RUN試劑盒的檢測原理

體內(nèi)富集與組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子（TF）復(fù)合的DNA，隨后進(jìn)行下一代測序，為研究全基因組蛋白質(zhì)-DNA相互作用提供了一個有利的工具。 它允許分析特定蛋白質(zhì)在活細(xì)胞中與DNA序列的結(jié)合。這種分析要求方法可靠地識別真正的目標(biāo)蛋白質(zhì)富集區(qū)域，特別是來自有限的細(xì)胞樣本。這些樣本可能包括從組織中分離出來的稀有細(xì)胞群體、從整個細(xì)胞群體中分選出來的特定細(xì)胞，以及如胚胎細(xì)胞等原代培養(yǎng)的亞群體細(xì)胞。此外，該方法應(yīng)確保富集的DNA含有最小的背景，并且以最小的偏差和高分辨率映射蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合區(qū)域。

長期以來，實現(xiàn)這一目標(biāo)的主要方法是染色質(zhì)免疫沉淀，隨后進(jìn)行測序（ChIP-Seq）。 然而，ChIP的主要限制是它需要1）大量的輸入材料，細(xì)胞或組織，以產(chǎn)生足夠強(qiáng)的信號以覆蓋背景噪聲；以及2）在初始固定步驟中進(jìn)行交聯(lián)。目前有幾種先進(jìn)的方法可用于ChIP-Seq，以減少細(xì)胞數(shù)量或提高分辨率。這些方法包括ChIP-exo和ChIPmentation。ChIP-exo提供高分辨率映射，但耗時且需要大量輸入細(xì)胞。而ChIPmentation使用轉(zhuǎn)座酶和與測序兼容的適配器，以實現(xiàn)ChIP過程中的連接整合，它遵循傳統(tǒng)的慢速（2天）ChIP程序，無法實現(xiàn)高分辨率映射。

CUT&RUN（Cleavage Under Target & Release Using Nuclease，目標(biāo)下切割與釋放使用核酸酶）是為釋放有限生物材料中捕獲的目標(biāo)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物以映射蛋白質(zhì)-DNA相互作用而開發(fā)的，它顯著提高了映射分辨率。 然而，CUT&RUN需要昂貴的PA/Mnase融合蛋白，該蛋白具有顯著的A/T序列偏差，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的DNA區(qū)域輪廓受到MNase消化水平的嚴(yán)重影響。因此，作為一種改進(jìn)，我們開發(fā)了一種新技術(shù)：目標(biāo)下切割并使用核酸酶快速恢復(fù)（CUT&RUN Fast），用于富集組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA。我們的創(chuàng)新方法結(jié)合了ChIP-exo和CUT&RUN的優(yōu)勢，并具有超級快的程序，將其整合到EpiNext™ CUT&RUN Fast試劑盒中。

艾美捷CUT&RUN試劑盒具有以下特點：

高富集度： 使用一種d特的核酸切割酶混合物，這種酶具有低序列偏差，能夠同時將染色質(zhì)片段化，并在目標(biāo)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物的兩端切割/移除任何DNA序列，而不影響目標(biāo)蛋白質(zhì)占據(jù)的DNA。富集的DNA片段大于20個堿基對，可以高效快速地回收。因此，可以在高分辨率映射中可靠地實現(xiàn)和識別目標(biāo)蛋白質(zhì)富集區(qū)域。

低輸入材料： 強(qiáng)大的無需超聲的片段化、未結(jié)合DNA的切割和免疫捕獲都在同一個單管中進(jìn)行，使用珠上連接。這種方法適用于細(xì)胞和組織，并允許最大限度地保護(hù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的降解，同時最小化樣本損失。結(jié)果，輸入的細(xì)胞數(shù)量可以少至500個，或者染色質(zhì)的量可以低至0.1微克。

最小化背景： 在目標(biāo)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物的兩端原位切割未結(jié)合的DNA序列，能夠最小化免疫捕獲的背景，允許進(jìn)行少于1000萬次讀取的測序數(shù)據(jù)分析。

快速、流程簡化的程序： 從細(xì)胞到文庫DNA的程序不到3小時。

高度便捷： 試劑盒包含了CUT&RUN每個步驟所需的所有組分，因此EpiNext™ CUT&RUN Fast試劑盒是方便的，能夠提供可靠和一致的結(jié)果。

EpiNext™ CUT&RUN Fast試劑盒包含了從哺乳動物細(xì)胞或分離的核/染色質(zhì)開始執(zhí)行成功CUT&RUN所需的所有必要試劑。 在反應(yīng)中，從細(xì)胞中分離出核。目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物通過感興趣的CHIP級抗體進(jìn)行結(jié)合/捕獲。使用一種d特的核酸切割酶混合物，染色質(zhì)被片段化，目標(biāo)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物兩端的DNA序列被切割/移除。同時，目標(biāo)蛋白質(zhì)占據(jù)的DNA序列不受影響。然后對目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA進(jìn)行純化和洗脫。富集的DNA可用于分析蛋白質(zhì)-DNA相互作用，尤其是用于下一代測序。

試劑盒中包括： 一個陽性對照抗體（抗H3K9me3）、一個陰性對照非免疫IgG，以及控制染色質(zhì)，這些可以用來在PCR/生物分析儀步驟中展示試劑盒的效果和性能。

CUT&RUN試劑盒檢測原理：

圖 1. EpiNext™ CUT&RUN Fast試劑盒的工作流程。

圖 2. 使用EpiNext™ CUT&RUN Fast試劑盒進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)/DNA富集： 通過控制抗體（抗H3K9me3和抗RNA聚合酶II，EpigenTek）從100,000個Jurkat細(xì)胞中捕獲組蛋白/DNA復(fù)合物。非免疫IgG作為對照。富集的DNA被純化并通過熒光定量以比較富集倍數(shù)。

圖3。庫片段的大小分布。使用EpiNext™CUT&RUNFast試劑盒，組蛋白DNA復(fù)合物被對照抗體（H3K9me3）從Hela細(xì)胞分離的1 ug染色質(zhì)中捕獲，并用于DNA文庫制備。290 bps左右的峰值反映了單核小體的插入大?。?/span>150 bps）。