CUT&RUN丨CUT&RUN RNA m6A-Seq，操作時(shí)間少于1小時(shí)

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物RNA分子上Z常見(jiàn)和Z豐富的修飾。m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體METTL3催化，并通過(guò)m6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5去除，這些酶以α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依賴的方式催化m6A去甲基化。已知METTL3、FTO和ALKBH5在許多生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括發(fā)育、代謝和生育。m6A占所有RNA堿基甲基化的80%以上，存在于不同物種中。m6A主要分布在mRNA中，也出現(xiàn)在非編碼RNA中，如tRNA、rRNA和snRNA。m6A在mRNA轉(zhuǎn)錄本中的相對(duì)豐度已被證明可以影響RNA代謝過(guò)程，如剪接、核輸出、翻譯能力和穩(wěn)定性以及RNA轉(zhuǎn)錄。由于m6A RNA甲基化酶和去甲基化酶缺陷引起的m6A甲基化水平異常可能導(dǎo)致RNA功能障礙并引起疾病。例如，由于FTO突變患者中FTO活性增加，通過(guò)尚未定義的途徑，目標(biāo)mRNA中m6A水平異常低，有助于肥胖及相關(guān)疾病的發(fā)生。RNA上動(dòng)態(tài)可逆的化學(xué)m6A修飾也可能作為具有深遠(yuǎn)生物學(xué)意義的新表觀遺傳標(biāo)記。因此，更多有助于更好理解m6A RNA甲基化水平和分布的有用信息，可以促進(jìn)疾病的診斷和治療。

目前，有幾種方法用于表觀轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A定位。這些方法包括MeRIP-seq、PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP。MeRIP-seq已被廣泛使用，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)m6A分析的高分辨率。PA-m6A-seq、miCLIP和m6A-CLIP提高了分析分辨率，但存在可重復(fù)性差和過(guò)程復(fù)雜的問(wèn)題。特別是，這些方法耗時(shí)（>2天）且成本高。

為了解決這些問(wèn)題，EpigenTek開(kāi)發(fā)了一種新方法：CUT&RUN RNA m6A-Seq（在目標(biāo)下切割并使用核酸酶回收用于m6A測(cè)序）。我們的創(chuàng)新方法結(jié)合了MeRIP和m6A-CLIP的優(yōu)勢(shì)，具有z快的程序，并將其整合到EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒中。

艾美捷 EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒（P-9016）特點(diǎn)：

1、高富集度：使用RNA切割酶混合液同時(shí)切割RNA，并在目標(biāo)m6A含有序列的兩端切割/移除任何RNA序列，而不會(huì)影響抗體占據(jù)的RNA區(qū)域。僅與抗m6A抗體結(jié)合的短RNA片段被生成。因此，可以可靠地識(shí)別真正的目標(biāo)m6A富集區(qū)域，并實(shí)現(xiàn)高分辨率定位。

2、低輸入量：未結(jié)合的RNA切割和免疫捕獲在同一個(gè)管中進(jìn)行，這使得目標(biāo)m6A含有區(qū)域得到一定程度的保護(hù)，同時(shí)Z小化樣本損失，允許輸入RNA低至500納克。

3、Z小背景：在目標(biāo)m6A含有序列的兩端切割未結(jié)合的RNA序列，能夠Z小化MeRIP/測(cè)序背景，允許數(shù)據(jù)分析時(shí)讀取數(shù)少于1000萬(wàn)次。

4、快速、簡(jiǎn)化的程序：從RNA到cDNA庫(kù)的程序少于6小時(shí)，且操作時(shí)間少于1小時(shí)。

5、高度方便：試劑盒包含CUT&RUN RNA m6A-Seq的每個(gè)步驟所需的所有組分，這些組分足以進(jìn)行m6A含有RNA序列捕獲和捕獲的cDNA庫(kù)制備，因此使CUT&RUN RNA m6A-Seq成為Z方便、可靠且結(jié)果一致的方法。

CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒檢測(cè)原理：

EpiNext™ CUT&RUN RNA m6A-Seq試劑盒包含了從總RNA開(kāi)始進(jìn)行成功的m6A-Seq所需的所有必要試劑。在反應(yīng)中，目標(biāo)m6A含有區(qū)域兩端的RNA序列被切割/移除，并且使用結(jié)合有m6A捕獲抗體的珠子捕獲目標(biāo)m6A含有片段。然后，目標(biāo)m6A含有的RNA片段被回收、釋放、逆轉(zhuǎn)錄，并連接接頭。連接后的第一條鏈cDNA被擴(kuò)增，然后用作文庫(kù)合成的模板。使用高保真PCR混合液進(jìn)行文庫(kù)cDNA的擴(kuò)增和索引。然后使用結(jié)合珠子清理cDNA。試劑盒中還包括一個(gè)陰性對(duì)照非免疫IgG，可以用來(lái)展示試劑盒的效果，并在富集RNA定量或生物分析儀分析步驟中展示性能。

EpiNext™CUT&RUN-RNA m6A-Seq試劑盒的工作流程。