WRN解旋酶活性測(cè)定試劑盒，熒光測(cè)定檢測(cè)方案

WRN解旋酶活性測(cè)定試劑盒是一種熒光測(cè)定法，旨在通過監(jiān)測(cè)WRN（Werner綜合征ATP依賴性Helicase）拮抗劑/抑制劑對(duì)WRN催化的DNA解旋的影響來篩選和分析WRN拮抗劑/抑制劑。WRN Helicase活性檢測(cè)試劑盒采用方便的96孔格式，含有足夠的純化重組WRN、ATP、DNA底物、檢測(cè)緩沖液和添加劑，可用于100個(gè)反應(yīng)。

艾美捷WRN解旋酶活性測(cè)定試劑盒：

貨號(hào): BPS-78852

同義詞：雙功能3'-5'外切酶/ATP依賴性解旋酶WRN，DNA解旋酶，RecQ樣型3，RecQ蛋白樣2，Werner綜合征蛋白，ATP依賴性解旋酶，3'-5'外切酶，RECQ3，RECQL2

檢測(cè)試劑盒格式：熒光法

物種：人類

需自備材料：能夠讀取激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)=525 nm/592 nm的熒光微孔板閱讀器。

UniProt ：#Q14191

儲(chǔ)存/穩(wěn)定性：如果按照指示儲(chǔ)存材料，該檢測(cè)試劑盒從收到之日起最佳性能可維持長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。

應(yīng)用：篩選影響WRN解旋酶活性的小分子抑制劑或拮抗劑，在高通量篩選（HTS）應(yīng)用中。

運(yùn)輸溫度：-80°C

注：反應(yīng)中DMSO的最終濃度不應(yīng)超過1%。

WRN解旋酶活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)協(xié)議：

所有樣品和對(duì)照應(yīng)成對(duì)進(jìn)行。

檢測(cè)應(yīng)包括“陰性對(duì)照"、“陽(yáng)性對(duì)照"和“試驗(yàn)抑制劑"條件。

我們建議在實(shí)驗(yàn)中將稀釋后的蛋白質(zhì)保持在冰上。

有關(guān)蛋白質(zhì)處理的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱蛋白質(zhì)常見問題解答，

我們推薦使用HRO761作為內(nèi)部對(duì)照。如果不對(duì)控制抑制劑進(jìn)行劑量反應(yīng)曲線測(cè)試，我們建議按照下面驗(yàn)證數(shù)據(jù)中顯示的IC50值的0.1倍、1倍和10倍來運(yùn)行控制抑制劑。

準(zhǔn)備4倍濃縮WRN緩沖液：向4毫升4倍WRN緩沖液中加入40微升0.5M DTT并混勻。

準(zhǔn)備1倍WRN緩沖液：用蒸餾水將1毫升4倍濃縮WRN緩沖液稀釋4倍?；靹?。

在冰上解凍WRN。短暫離心含有蛋白質(zhì)的管子以回收管子的全部?jī)?nèi)容物。

將WRN用1倍WRN緩沖液稀釋至5納克/微升。每個(gè)孔需要40微升。

向“陽(yáng)性對(duì)照"和“試驗(yàn)抑制劑"孔中各加入40微升稀釋后的WRN。

向“陰性對(duì)照"孔中加入40微升1倍WRN緩沖液。

準(zhǔn)備試驗(yàn)抑制劑（每個(gè)孔5微升）：對(duì)于滴定，準(zhǔn)備比期望最終濃度高10倍的連續(xù)稀釋。反應(yīng)的最終體積為50微升。

向“試驗(yàn)抑制劑"孔中加入5微升試驗(yàn)抑制劑。

向“陰性對(duì)照"和“陽(yáng)性對(duì)照"孔中各加入5微升溶劑溶液。

輕輕晃動(dòng)板子，然后在室溫(RT)下孵育15-20分鐘。

解凍ATP（200 mM）并保持在冰上。

將ATP在1倍WRN緩沖液中稀釋5倍至40 mM濃度。每個(gè)孔需要2.5微升。注意：將未使用的ATP分裝成單次使用的小份，并立即存放在-80°C。

在冰上解凍WRN底物。短暫離心含有WRN底物的管子以回收管子的全部?jī)?nèi)容物。

將WRN底物在1倍WRN緩沖液中稀釋12.5倍。每個(gè)孔需要2.5微升。注意：將未使用的WRN底物分裝成單次使用的小份，并立即存放在-80°C。

準(zhǔn)備主混合物，按1:1的比例混合稀釋后的ATP（40 mM）和稀釋后的WRN底物，如下：N個(gè)孔 × （2.5微升稀釋后的WRN底物 + 2.5微升稀釋后的ATP）。

通過向所有孔中加入5微升上述制備的主混合物來啟動(dòng)反應(yīng)。

輕輕晃動(dòng)板子，并立即放入能夠讀取λexc/λem=525 nm/592 nm的熒光微孔板閱讀器中。

在25分鐘后讀取終點(diǎn)熒光，或在加入主混合物后使用動(dòng)力學(xué)模式讀取幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)。推薦的時(shí)間間隔為5分鐘。

通過從其他值中減去“陰性對(duì)照"的值來計(jì)算結(jié)果。

WRN解旋酶活性測(cè)定試劑盒示例結(jié)果：

圖:WRN的滴定。在WRN和2 mM ATP含量增加的情況下測(cè)量熒光。