ALPCO-c-肽ELISA測(cè)定程序及標(biāo)準(zhǔn)曲線參考

ALPCO C肽ELISA用于定量測(cè)定人血清和血漿中的C肽。

艾美捷c-肽ELISA（ALP-80-CPTHU-E01.1）檢測(cè)原理：

ALPCO C肽ELISA是一種夾心型免疫分析法。96孔微孔板涂有針對(duì)C肽的單克隆抗體。標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本與測(cè)定緩沖液一起加入微孔板孔中。然后，微孔板在室溫下以700-900轉(zhuǎn)每分鐘的速度在微孔板振蕩器上孵育。第一次孵育完成后，用洗滌緩沖液清洗孔并吸干。然后加入結(jié)合物，微孔板再次在設(shè)定為700-900轉(zhuǎn)每分鐘的微孔板振蕩器上孵育，洗滌并吸干。加入TMB底物，微孔板在室溫下第三次在設(shè)定為700-900轉(zhuǎn)每分鐘的微孔板振蕩器上孵育。第三次孵育完成后，加入停止溶液，并通過(guò)分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)量光密度（OD）。產(chǎn)生的色度強(qiáng)度與樣本中C肽的含量成正比。

供應(yīng)的材料：

Component Quantity Preparation

C-peptide Microplate (96 wells) 12x8 strips Ready to use

Zero Standard (0 pM) 5 mL Ready to use

"Standards  (A-E)

(20,100,300,1000,3000 pM)*" 1 vial each Lyophilized*

Diabetes Control Levels 1 and 2* 1 vial each Lyophilized*

Assay Buffer 6 mL Ready to use

Conjugate Stock 1.2 mL 11X

Conjugate Buffer 12 mL Ready to use

Wash Buffer Concentrate 40 mL 21X

TMB Substrate 12 mL Ready to use

Stop Solution 12 mL Ready to use

Plate Sealers 3 Ready to use

*請(qǐng)參閱每個(gè)試劑盒隨附的分析證書(shū)，了解批次特定的標(biāo)準(zhǔn)濃度、控制范圍和復(fù)溶量。

c-肽ELISA測(cè)定程序：

使用前應(yīng)將所有試劑和微孔板條平衡至室溫（18-25°C）。使用前輕輕混合所有試劑。每次測(cè)定運(yùn)行和每次使用多個(gè)微孔板時(shí)，都必須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。所有標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本都應(yīng)雙重測(cè)定。

1. 在打開(kāi)鋁箔袋之前，應(yīng)將微孔板平衡至室溫。為標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本的雙重測(cè)定準(zhǔn)備足夠的微孔板條。剩余的微孔板條應(yīng)存放在含有干燥劑的緊閉鋁箔袋中，儲(chǔ)存在2-8°C。

2. 分別向各自孔中移液25 µL的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣本。參見(jiàn)試劑準(zhǔn)備。

3. 向每個(gè)孔中移液50 µL的測(cè)定緩沖液。

4. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，振蕩速度為700-900 rpm。

5. 倒掉孔中的內(nèi)容物，并使用微孔板洗滌器每次用350 µL的工作強(qiáng)度洗滌緩沖液洗滌微孔板6次（參見(jiàn)試劑準(zhǔn)備）?；蛘撸褂门鋫湎礈靽娮斓南礈炱繉⒐ぷ鲝?qiáng)度洗滌緩沖液注入孔中。（不建議使用多通道移液器。必須用足夠且相等的力量分配洗滌緩沖液，以便正確洗滌孔。）在洗滌之間，將微孔板倒置以丟棄液體，并在吸水紙上用力拍打倒置的微孔板。在最后一次洗滌后（自動(dòng)或手動(dòng)），通過(guò)倒置并在吸水紙上用力拍打微孔板，從孔中去除任何殘留的洗滌緩沖液和氣泡。

6. 向每個(gè)孔中移液100 µL的工作強(qiáng)度結(jié)合物（參見(jiàn)試劑準(zhǔn)備）。

7. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下振蕩孵育1小時(shí)，振蕩速度為700-900 rpm。

8. 倒掉孔中的內(nèi)容物，并使用350 µL的工作強(qiáng)度洗滌緩沖液洗滌微孔板6次（參見(jiàn)步驟5）。

9. 向每個(gè)孔中移液100 µL的TMB底物。

10. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下振蕩孵育15分鐘，振蕩速度為700-900 rpm。

11. 向每個(gè)孔中移液100 µL的停止溶液，并輕輕搖晃微孔板以混合內(nèi)容物。在進(jìn)行下一步之前去除任何氣泡。

12. 將微孔板放入能夠讀取450nm吸光度的微孔板讀取器中。在加入停止溶液后應(yīng)立即分析微孔板，且不得超過(guò)30分鐘。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：

以下結(jié)果僅用于演示目的，不能代替通過(guò)測(cè)定獲得的數(shù)據(jù)。

c-肽ELISA文獻(xiàn)參考：

Finlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 2007; 9(2): E260-E267.