Jackson ImmunoResearch側流免疫層析（試紙條）親和純化IgG方案

側流免疫層析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA；也簡稱為側向層析）是一種基于抗原、抗體免疫反應的經典床旁檢測技術（point of care testing，POCT）。側流免疫層析試紙條，是一種在不使用實驗室設備的情況下確認目標分析物是否存在的簡易便攜裝置，作為是一種低成本、直接的方法，被廣泛應用于檢測人類和動物的感染或生物標志物，以及水、食物和動物飼料中的污染物和有害物質。

側流免疫層析常見形式

側流免疫層析的3種常見形式：直接法（圖1）、夾心法（圖2）和競爭法（圖3）。每個測試都是以線性條帶形式運行的，由分離和檢測感興趣的分析物所需的材料制成，并提供一個對照反應以確認測試的正確進行。下面的例子概述了側流免疫層析的基本原理，并簡要地強調了條帶的組成部分和它們的功能。

關鍵試劑

抗體 - 親和力和特異性

選擇正確的抗體是開發(fā)成功的側向流動免疫測定法的關鍵因素。

“如果沒有認真測試篩選合適的抗體，那么再多的優(yōu)化都無法克服這種固有的缺陷"（Brown，2008 年）

親和力

親和力特別重要，因為抗原的相對豐度可能很低。由于抗原、抗體偶聯(lián)物和包被的抗體在測試條的分析區(qū)域中相互作用僅幾秒鐘，因此需要快速的 kon速率和慢的 koff速率。

特異性

抗體必須能特異性地識別目標抗原，而不能檢測類似或同源的蛋白質和分子。由于在LFIA測試中使用了高濃度的抗體（通常比ELISA板孔中的抗體濃度高25-100倍），出色的特異性也是至關重要的。膠體金抗體偶聯(lián)物通常以每次30-250ng的量被使用。如果假設樣品在10-50ul內使標記的抗體再水化，那么抗體結合物的濃度將在0.6到20ug/ml之間。在較高的濃度下，抗體可能是其Kd的100倍，這可能會促使結合力弱、特異性低的抗體產生非特異性的相互作用，從而導致假陽性。

數(shù)量

首先要考慮的因素之一是啟動和維持商業(yè)產品所需的數(shù)量。如果每條帶 1ug 的捕獲抗體并希望制作 100 萬條，則所需的抗體量至少為 1g。因此，確保供應商能夠以一致的質量生產大批量產品至關重要。如果要在內部制造抗體，則必須注意選擇合適的抗原、免疫方法、篩選策略和放大工藝。

克隆性

單克隆抗體

單克隆抗體 (MAb) 的開發(fā)和生產是獲得具有所需屬性和保證質量穩(wěn)定的抗體的有效方法。然而，在體外條件下的放大可能會很昂貴，并且在純化運行之間可能會出現(xiàn)批次間的差異。篩選單克隆抗體以識別那些在膜結合、標記和與最終測定中使用的其他抗體一起表現(xiàn)良好的單克隆抗體也很重要。抗體在與膜結合時作為捕獲劑工作良好，但在與報告分子結合時表現(xiàn)不佳的情況并不少見。最后，篩選還必須識別在實驗條件下識別檢測形式中表位的抗體，例如緩沖液成分或抗原的構象結構。

多克隆抗體

多克隆抗體 (PAb) 的生產很容易擴大規(guī)模，無論是使用兔子、山羊、雞還是驢作為宿主動物。PAb 的另一個優(yōu)點是它們也可用于實現(xiàn)更高的檢測靈敏度。作為IgG的混合物，每種IgG同時和組合識別抗原上的不同表位，它們允許沉積更多的報告分子，從而增加信號。PAb 可能存在批次間差異，但由于它們是由宿主動物的免疫系統(tǒng)產生的，可能會隨著時間而改變。

驗證

無論來源或制造方法如何，都需要使用相應的工作流程來檢驗，以確保測試的一致性和可重復性。

對照線/質控線—抗體（Control Reagents）

雖然開發(fā)或選擇合適的捕獲和檢測抗體對檢測的性能至關重要，但在LFIA中使用的控制試劑的選擇也很重要。與報告分子偶聯(lián)的IgG或二抗通常被用來設置必要的對照線/質控線，以確保測試的正確可信。例如，陽性對照線可以用抗雞的二級抗體，該抗體與偶聯(lián)的雞IgY結合。雞IgY經常被使用，因為與哺乳動物IgG相比，雞IgG的同源性和序列特征較低，因此產生的非特異性相互作用較少。對照線抗體也應該與LFIA中使用的其他抗體有最小的交叉反應，因為如果測試中使用的IgG或樣品中存在的IgG干擾了對照試劑的結合，那么對照線的強度就會有很大的變化。

用于血清學測試的捕獲抗體和檢測抗體

血清學LFIA，使用抗體來捕獲或檢測由患者免疫反應產生的IgG。在血清學LFIAs中，檢測線是涂有抗原的，而病人的樣本中含有特定同型的抗原IgG，通過與病人血液中的IgG結合，而產生信號，該抗體與檢測線上的抗原相結合（見圖1）。檢測抗體的特異性很關鍵，它不應該與檢測中使用的其他物種的抗體或其他同種型的抗體結合。例如，在獨立檢測IgG和IgM同種型的檢測中，抗IgG抗體不能與IgM發(fā)生交叉反應，而抗IgM抗體不能檢測IgG。

報告分子與偶聯(lián)物

常用于側流免疫層析的報告分子包括膠體金、乳膠珠和熒光染料。每種選擇都有明顯的優(yōu)勢，選擇取決于檢測目標和檢測讀出方法。其他標簽包括順磁顆粒、酶、量子點、纖維素納米珠、納米金、二氧化硅納米顆粒、生物發(fā)光和發(fā)光材料，以及上轉換熒光劑（Goryacheva等，2013，Quesada-González & Merko?i，2015，和（Guo等，2021）

膠體金（Colloidal Gold）

膠體金是一種廣泛用于LFIA的偶聯(lián)物，因為它能產生強烈的顏色，易于偶聯(lián)，并且它的質量穩(wěn)定。典型的尺寸在40-80nm之間，其中40nm是最常見的。

金顆粒與抗體的結合通常是通過靜電和疏水的相互作用被動進行的。這兩個實體在低離子強度的緩沖液中混合，然后用多元醇或蛋白質如白蛋白或酪蛋白進行封閉。膠體金也有活化的表面，如羧基，允許在必要時進行共價連接。

乳膠微粒

乳膠顆粒用途廣泛，自其最初開發(fā)以來一直被用于側向流檢測。顆粒可以裝載彩色和/或熒光染料、順磁顆粒和其他化學品。不同顏色的染料可以進行多種同時讀出的檢測。用于LFIA的標準尺寸范圍為100-300um。綴合方法在吸附或共價連接之間變化，取決于表面化學。乳膠珠的敏感度可能低于膠體金，因為它們的大尺寸使它們不能密集地包裝在測試或控制線上。

熒光染料

熒光染料作為標簽得到了青睞；作為小分子（<1nm），它們比較大的納米顆粒更容易從偶聯(lián)墊中釋放出來。染料有助于通過一個LFIA設備對多種分析物進行定量和檢測（Wild，2016），盡管它們需要使用特殊的閱讀設備來顯示結果并充分利用染料的特性。適用于LFIAs的熒光團應該是經濟的，具有長斯托克斯位移，良好的量子產率，并且是光穩(wěn)定的。染料有多種形式，便于與蛋白質和小分子上的伯胺和巰基共價偶聯(lián)。熒光素Fluorescein 和Cyanine染料是流行的選擇。

一些染料可能不適合用于LFIA，因為在高濃度下會出現(xiàn)光漂白或淬滅。結合活性可能會因為發(fā)生在抗體副體或目標表位的關鍵點上的共價偶聯(lián)而受到影響，或者因為疏水性染料引起的聚集。

以上，是艾美捷總結的一些關于側流免疫層析（試紙條）親和純化IgG抗體的相關資料。