羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(14uM甲醇)應(yīng)用方案

鬼筆環(huán)肽是一種來自毒鵝膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能夠特異性且高親和力（解離常數(shù)Kd為20 nM）地結(jié)合到聚合態(tài)肌動蛋白（F-肌動蛋白）上。鬼筆環(huán)肽可將肌動蛋白聚合的臨界濃度降低至不到1 µg/ml，從而作為聚合增強(qiáng)劑發(fā)揮作用。鬼筆環(huán)肽已被四甲基羅丹明B異硫氰酸酯（1）標(biāo)記，廣泛用于替代肌動蛋白抗體，特異性地標(biāo)記組織培養(yǎng)細(xì)胞和組織切片（2，見圖1）以及無細(xì)胞體系中的肌動蛋白絲。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽肌動蛋白絲保留了許多未標(biāo)記肌動蛋白的功能特性，包括其與肌球蛋白相互作用的能力。

艾美捷羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(14uM甲醇)#PHDR1：

材料：羅丹明鬼筆環(huán)肽以粉紅色固體形式提供，分子量為1306。1×工作液的PHDR1足以對300-350個蓋玻片（22×22 mm）上的細(xì)胞進(jìn)行染色（圖1）。

注意：鬼筆環(huán)肽有毒，必須小心處理（人LD50 = 2 mg/Kg）。

儲存與復(fù)溶：- 室溫運輸。短暫離心以將產(chǎn)品收集到試管底部。用500 µL 100%甲醇復(fù)溶，制備14 µM溶液。建議將溶液分裝成10份×50 µL，置于-20°C避光保存，可穩(wěn)定保存6個月。凍干產(chǎn)品在4°C干燥（<10%濕度）條件下可穩(wěn)定保存1年。

免疫熒光應(yīng)用方案：

用于組織培養(yǎng)細(xì)胞中肌動蛋白絲的熒光染色有多種方法。固定程序?qū)τ讷@得細(xì)胞內(nèi)F-肌動蛋白分布的真實表現(xiàn)至關(guān)重要。應(yīng)根據(jù)實驗要求選擇固定方法。用甲醛或戊二醛固定組織培養(yǎng)細(xì)胞，可獲得良好的肌動蛋白絲染色效果和片狀偽足的保存效果。

試劑：

1. 羅丹明鬼筆環(huán)肽（貨號PHDR1）

2. 在玻璃蓋玻片上生長至半融合狀態(tài)的瑞士3T3細(xì)胞

3. 可以從Cytoskeleton, Inc.獲取F-肌動蛋白染色試劑盒（貨號BK005），或者自行準(zhǔn)備以下4至7號試劑

4. 磷酸鹽緩沖液（PBS，50 mM磷酸鉀，pH 7.4，50 mM NaCl）

5. 固定液（PBS中的4%甲醛，需要將pH調(diào)至7.0）

6. 通透緩沖液（PBS中的0.5% Triton X-100）

7. 抗淬滅封固介質(zhì)（Fluka BioChemika，貨號10981）

8. PBS中的100 nM DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）

9. 玻璃載玻片（25×75×1 mm）

10. 封固蓋玻片的溶液（透明指甲油）

圖1：瑞士3T3細(xì)胞中的肌動蛋白應(yīng)力纖維

圖例：瑞士3T3細(xì)胞在玻璃蓋玻片上生長至半融合狀態(tài)，并按方法描述用羅丹明鬼筆環(huán)肽固定和染色。細(xì)胞在配備數(shù)字CCD相機(jī)和100×物鏡的熒光顯微鏡下觀察。注意細(xì)胞中廣泛分布的肌動蛋白應(yīng)力纖維（紅色）。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）復(fù)染。

設(shè)備：

1. 熒光顯微鏡，配備羅丹明的激發(fā)濾光片（535±20 nm）和發(fā)射濾光片（585±20 nm），以及DAPI的激發(fā)濾光片（355±20 nm）和發(fā)射濾光片（460±20 nm）。

2. 數(shù)字CCD相機(jī)。

方法：

1. 在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞，直至半融合。

2. 通過將3.5 µL 14 µM標(biāo)記的羅丹明鬼筆環(huán)肽儲備液稀釋到500 µL PBS中，制備100 nM的工作液。在室溫下避光保存。

3. 移去培養(yǎng)基，用37°C的PBS輕輕洗滌細(xì)胞一次。

4. 在室溫下用固定液固定細(xì)胞10分鐘。

5. 在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞一次，持續(xù)30秒。

6. 在室溫下用通透緩沖液通透細(xì)胞5分鐘。

7. 在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞一次，持續(xù)30秒。

8. 將蓋玻片移至濕盒中的蠟紙上，加入200 µL 100 nM羅丹明鬼筆環(huán)肽。在室溫下避光孵育30分鐘。

9. 用PBS洗滌蓋玻片三次。

10. 用200 µL 100 nM DAPI在PBS中復(fù)染DNA 30秒。

11. 用PBS沖洗蓋玻片，并將其倒置在玻璃載玻片上的抗淬滅封固介質(zhì)滴上。用紙巾輕輕擦去多余介質(zhì)，并用指甲油密封四周。

12. 將載玻片置于4°C避光保存。

13. 典型的F-肌動蛋白染色結(jié)果見圖1。