所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
實(shí)驗(yàn)材料    細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒    RNA提取試劑盒熒光定量PCR MixTRIZOLdNTP逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2瓊脂糖溴化乙錠MOPS甲醛乙酸鈉EDTAEB溴酚蘭
儀器、耗材    離心管離心機(jī)風(fēng)光光度計(jì)電泳槽凝膠板Realtime PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、 樣品RNA的抽提
 
1.  取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
 
2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
 
3.  RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
 
4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
 
5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
 
6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
 
二、 RNA質(zhì)量檢測(cè)
 
1.  紫外吸收法測(cè)定
 
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
 
 （1）濃度測(cè)定
 
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計(jì)算如下：
 
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀釋至495 μl的TE中，測(cè)得A260 = 0.21
 
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
 
取5 ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：
 
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
 
（2）純度檢測(cè)
 
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
 
2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
 
（1）制膠
 
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液
濃度  成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸鈉
0.01 M  EDTA
 
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
 
（2）準(zhǔn)備RNA樣品
 
取3 μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
 
（3）電泳
 
上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。
 
（4）紫外透射光下觀察并拍照
 
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。
 
三、樣品cDNA合成
 
1.  反應(yīng)體系
 
序號(hào)          反應(yīng)物           劑量
1          逆轉(zhuǎn)錄buffer       2 μl
2         上游引物              0.2 μl
3         下游引物              0.2 μl
4          dNTP                   0.1 μl
5       逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV     0.5 μl
6         DEPC水              5 μl
7          RNA模版            2 μl
8           總體積               10 μl
 
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 
2.  混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，37℃水浴60分鐘。
 
3.  取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。
 
四、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR
 
1.  β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3 μl按10倍稀釋（加水27 μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
 
2.  反應(yīng)體系如下：
 
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
 
序號(hào)           反應(yīng)物                           劑量
1       SYBR Green 1 染料             10 μl
2       陽(yáng)性模板上游引物F              0.5 μl
3      陽(yáng)性模板下游引物R              0.5 μl
4                 dNTP                            0.5 μl
5                 Taq酶                           1 μl
6           陽(yáng)性模板DNA                    5 μl
7              ddH2O                            32.5 μl
8               總體積                            50 μl
 
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 
3.  管家基因反應(yīng)體系：
 
序號(hào)            反應(yīng)物                                劑量
1      SYBR Green 1 染料                   10 μl
2      內(nèi)參照上游引物F                         0.5 μl
3     內(nèi)參照下游引物R                         0.5 μl
4               dNTP                                    0.5 μl
5               Taq酶                                   1 μl
6      待測(cè)樣品cDNA                             5 μl
7              ddH2O                                  32.5 μl
8             總體積                                    50 μl
 
輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。
 
3.  制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
 
五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板
 
1.  針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 
2.  反應(yīng)體系
 
序號(hào)                     反應(yīng)物                        劑量
1                     10× PCR緩沖液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物F                 0.5 ul
4                           下游引物R                0.5 ul
5                            dNTP混合液            3 ul
6                            Taq聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至總體積為               25 ul
 
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
 
35個(gè)PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。
 
（3）PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。
 
（4）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。
 
六、 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

1.  所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。
 
2.  體系配置如下：
 
序號(hào)             反應(yīng)物                                劑量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq聚合酶                               2 ul
6             待測(cè)樣品cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   總體積                               50 ul
 
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 
（3）將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，后72℃7分鐘延伸。
 
七、 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表
 
引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
 
八、電泳
 
各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。