近年來(lái)單克隆抗體已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究［1］。如何制備質(zhì)量好產(chǎn)量高的單克隆抗體是當(dāng)前各有關(guān)實(shí)驗(yàn)室研究的重要問(wèn)題，通常用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法有兩種：①利用純系小鼠生產(chǎn)免疫腹水，該法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)量和效價(jià)高，但純化困難，價(jià)格昂貴，生產(chǎn)周期長(zhǎng)；②雜交瘤細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)法，此法雖然產(chǎn)量不價(jià)低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，較易純化且成本低，但此法若需大量生產(chǎn)則需特殊設(shè)備［2］。近有人報(bào)道用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)也可提高單克隆抗體的產(chǎn)量且方法簡(jiǎn)便［3］。經(jīng)我們對(duì)3株抗人衰變加速因子（Decay-Accelerating Factor，DAF，CD55）單克隆抗體的制備和產(chǎn)量測(cè)定，獲得較為滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 純化抗原及抗體 純化的可溶性重組DAF由英國(guó)Reading大學(xué)Goodfellow博士惠贈(zèng)。抗人DAF單克隆抗體IC6培養(yǎng)上清（1μg／ml）由日本Fukushima醫(yī)學(xué)院Fujita博士惠贈(zèng)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（工作濃度1∶1000），購(gòu)自中山生物制品有限公司。

1.2 培養(yǎng)基 RPMI 1640（Gibco產(chǎn)品），含2mmol L-谷氨酰胺，100U／ml青霉素，100μg／ml鏈霉素和10％FCS。

1.3 雜交瘤細(xì)胞系 DA11、DG3、DG9雜交瘤細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室建立，經(jīng)SP2／0與免疫小鼠脾細(xì)胞融合篩選而成，抗體亞類均為IgG1，能穩(wěn)定分泌抗人DAF單克隆抗體［4］。

1.4 平臥式常規(guī)法培養(yǎng) 將DA11、DG3、DG9雜交瘤細(xì)胞用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)在25ml的方瓶中加培養(yǎng)液5ml，置37°C孵箱3～4d后，當(dāng)瓶中只剩下少于5％有活力的細(xì)胞時(shí)離心收集上清，－20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 直立式培養(yǎng) 將DA11、DG3、DG9雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在平臥式細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直到細(xì)胞密度達(dá)90％～95％時(shí)，補(bǔ)充培養(yǎng)液至瓶頸（總量為30ml），加橡皮塞直立式放置在37°C孵箱中，每天觀察細(xì)胞并晃動(dòng)1次，可見(jiàn)死細(xì)胞不斷脫落至瓶底，活細(xì)胞繼續(xù)增殖，直到培養(yǎng)液變酸后離心收集上清，－20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以不同濃度的IC6上清進(jìn)行間接ELISA（具體步驟見(jiàn)1.7），每一濃度重復(fù)3孔，測(cè)得OD值，進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 單克隆抗體含量測(cè)定 采用間接ELISA法，具體步驟如下：（1）包被純化人DAF于96孔ELISA板，50μl／孔，4°C，18～24h。（2）用0.02M PBS＋0.05％Tween20（PBS-T）將板孔洗3次，3min／次，空干，加入不同濃度的鼠抗人DAF單克隆抗體上清，50μl／孔，37°C孵育50min。（3）同上洗滌，加入1∶1000羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗體，50μl／孔，37°C，50min。（4）同上洗滌，加入鄰苯二胺-H2O2溶液37°C顯色20min后，在BIO-RAD Model 3550自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀上選擇490nm測(cè)OD值。平臥式與直立式培養(yǎng)收獲的上清及IC6上清同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，以SP2／0骨髓瘤細(xì)胞上清作為陰性對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每種樣品中的單抗含量。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理抗人DAF單克隆抗體IC6上清濃度在0．001～0．1μg／ml之間時(shí)，其含量與OD值呈線性關(guān)系（見(jiàn)圖1）。分別將平臥式和直立式收獲的

 

圖 1 IC6上清標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig 1Standard curves of supernatant of IC6

細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)及含量，結(jié)果3株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗人DAF單克隆抗體，其直立式培養(yǎng)上清的OD值均略高于平臥式培養(yǎng)的上清，將3株單克隆抗體的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其含量，結(jié)果見(jiàn)表1。直立式比平臥式產(chǎn)量提高8～14倍，與Susan等的結(jié)果相符。直立式的特點(diǎn)是培養(yǎng)液用量多，且在生長(zhǎng)過(guò)程中死亡細(xì)胞不斷脫落至瓶底，

表1 平臥式與直立式培養(yǎng)單抗產(chǎn)量比較

Tab 1 Production of mAbs in horizontal and standing flask methods

Cell line    Horizontal culture    Standing culture
Ig concentration
（μg／ml）

Total yiele
（μg／falsk）

Ig concentration
（μg／ml）

Total yiele
（μg／falsk）

DG3    22．97    114．85    35．89    1076．7
DG9    26．31    131．55    37．14    1114．2
DA11    26．91    134．55    65．45    1963．5
使培養(yǎng)瓶留出更多的空間供活細(xì)胞生長(zhǎng)而繼續(xù)分泌抗體；平臥式培養(yǎng)，則死亡細(xì)胞占據(jù)空間影響活細(xì)胞的分裂增殖，需傳代后方能繼續(xù)增殖，增加污染機(jī)會(huì)及工作量。

由于本法無(wú)需特殊設(shè)備、簡(jiǎn)便易行、節(jié)省人力物力，減少污染機(jī)會(huì)，一般實(shí)驗(yàn)室可推廣應(yīng)用。作者：女，37歲，本科，實(shí)驗(yàn)師

參考文獻(xiàn)

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3 Susan Ker hwe Ou，Paul HP，Terson T．A more efficient and economical approach for monclonal antibody production．J Immunol Methods，1997，209：105

4 鄒 強(qiáng)，謝佩蓉，鄭 萍.抗人DAF單克隆抗體的制備及鑒定.免疫學(xué)雜志，1999，15（2）：122