小鼠胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和體外分化
實(shí)驗(yàn)材料    母鼠
試劑、試劑盒    PBS胰蛋白酶溶液DNase 溶液
儀器、耗材    無(wú)菌解剖器械不銹鋼濾網(wǎng)燒瓶培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
1. 準(zhǔn)備下列試劑和材料：

確定懷孕期的母鼠（孕期14至6天）

無(wú)菌解剖器械（鑷子、剪刀、手術(shù)刀片）

Cellector 帶收集裝置的不銹鋼濾網(wǎng)，1 mm 直徑篩網(wǎng)

內(nèi)有攪拌棒的 125 ml 無(wú)菌的胰蛋白酶消化的燒瓶

有攪拌盤的培養(yǎng)箱

無(wú) Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS

胰蛋白酶溶液

DNase 溶液（10 mg/ml）

MEF 生長(zhǎng)培養(yǎng)基

MEF 凍存培養(yǎng)基

150 mm 和 100 mm 組織培養(yǎng)皿

2 ml 冷凍管

2. 殺死懷孕 14~16 天的母鼠，取出子宮，放在盛有 PBS 的 100 mm 組織培養(yǎng)皿中，取出胚胎，去胚胎外組織，PBS 沖洗去血。

3. 用無(wú)菌鑷子去胚胎頭和內(nèi)臟。

4. 胚胎轉(zhuǎn)移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 無(wú)菌離心管中，輕輕顛倒兩次。小心倒掉 PBS，再加 40 ml PBS 清洗。倒掉 PBS，留 10 ml 將胚胎轉(zhuǎn)移到 100 mm 培養(yǎng)皿。

5. 手術(shù)刀片細(xì)細(xì)切碎胚胎，用鑷子擠壓使其通過(guò)無(wú)菌濾網(wǎng)。15 ml 胰酶溶液沖洗濾網(wǎng)兩次，解剖胚胎混合物轉(zhuǎn)移至 125 ml 胰酶消化的燒瓶。加 400 μl DNase 粗品，以免釋放出的 DNA 導(dǎo)致溶液過(guò)黏。

6. 濕潤(rùn)的 5% CO2 溫箱中 37℃ 輕輕攪動(dòng)孵育 30 分鐘。

7. 由燒瓶側(cè)臂把上層細(xì)胞懸液倒入一裝有 10 ml MEF 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的 50 ml 離心管。

8. 離心收集細(xì)胞。

9. 30 ml MEF 生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗兩次。

10. 細(xì)胞懸于 15 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)可存活有核細(xì)胞（非血紅細(xì)胞或碎片）。10 只 15 天幼鼠可獲得 5X107 到 1X108 細(xì)胞。

11. 6X106 細(xì)胞懸于 25 ml MEF 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，接種一塊 150 mm 培養(yǎng)皿（總計(jì)接種 10~15 塊）。

12. 24 小時(shí)后更換新鮮 MEF 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

13. 約 2~4 天后細(xì)胞長(zhǎng)滿，1:5 傳代。分 8 批操作，15 ml PBS 沖洗，倒掉，加 10 ml 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分鐘。

14. 每塊胰酶消化的細(xì)胞板加 10 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕柔吹吸，分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管，兩塊板的細(xì)胞合并到一管中。

15. 離心收集細(xì)胞。細(xì)胞懸于培養(yǎng)基中，1:5 分加到 150 mm 培養(yǎng)皿。

16. 約 3 天后細(xì)胞長(zhǎng)滿，可以收獲凍存于液氮中。分 8 批操作，15 ml PBS 沖洗，倒掉，加 10 ml 胰酶，37℃ 孵育 5 分鐘。

17. 加 10 ml MEF 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕柔吹吸，分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到 50 ml 離心管。

18. 離心收集細(xì)胞。每塊培養(yǎng)皿收獲的細(xì)胞懸于 2 ml 凍存培養(yǎng)基。

19. 每支冷凍管加 1 ml 細(xì)胞，旋緊蓋子，-80℃ 冰箱過(guò)夜。此步操作需迅速。

20. 第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中。轉(zhuǎn)移過(guò)程中需放在干冰上避免升溫。