氨基酸(AA)測定試劑盒分光光度法說明書

                                               分光光度法  50管/48樣

 

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應肝、腎的生理狀態(tài)。另外，氨基酸還能反應灼傷、傷寒等方面情況。植物體內氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。

 

測定原理：

氨基酸的α-氨基可與水合茚三酮反應，產生藍紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通過測定570 nm吸光度，來計算氨基酸含量。

 

自備儀器及用品：

臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃避光保存。臨用前加入2 mL無水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入28mL蒸餾水混勻，避光保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加5 mL蒸餾水，充分溶解。

標準品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL標準液，4℃避光保存。

 氨基酸(AA)測定試劑盒分光光度法說明書

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1. 按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行室溫勻漿，然后轉移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來水冷卻后，8000g，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2. 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 血清等液體：直接檢測。

 

測定操作：

1. 分光光度計預熱30 min，調節(jié)波長到570 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取EP管，加入50μL蒸餾水，500μL試劑二，500μL試劑三和50μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A空白管。顯色后務必在30min內測完。

3. 標準管：取EP管，加入50μL標準品，500μL試劑二，500μL試劑三和50μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋

 

（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A標準管。顯色后務必在30min內測完。

4. 測定管：取EP管，加入50μL上清液，500μL試劑二，500μL試劑三和50μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A測定管。顯色后務必在30min內測完。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

 

氨基酸含量計算公式：

（1）按照樣本質量計算

氨基酸含量（μmol /g鮮重）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W

（2）按照樣本蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷（V樣×Cpr）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr

（3）按照細胞數量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數量）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

C標準品：標準品濃度，1 μ mol/mL；V標準品：反應體系中加入標準品體積，0.05 mL；W：樣品質量，g；V樣：反應體系中加入樣品提取液體積，0.05 mL；V樣總：樣品提取液總體積，1mL，Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。

 

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內使用完畢。

2. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應在570nm處無吸收峰，因此，570nm處測定結果不含這兩種氨基酸的量。

4檢出限為100μmol/L。

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