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T、B淋巴細胞分離試驗

閱讀:209          發(fā)布時間:2018-7-19
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實驗原理

本試驗的原理為:淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物(簡稱AET)處理的綿羊紅細胞(SRBC)混合后,其中全部T淋巴細胞均能吸附AET—SRBC,形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán),較正常未處理的SRBC形成的E—花環(huán)百分比為高,而且形成快速,不易脫落,重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細胞分層液分離時,AET—E花環(huán)易沉于管底,而未形成E—花環(huán)的T淋巴細胞,用低滲液解花環(huán)周圍的 AET—SRBC,便可獲得純T淋巴細胞,而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。
實驗試劑

1. 溴花二氨基異硫氫化物(AET)
2. 淋巴細胞分層液
3. 其它Hanks液,含小牛血清的199培養(yǎng)液,無菌生理鹽水,3.5%氯化鈉溶液等。
實驗設(shè)備

離心機,冰箱等。
實驗材料

1. 新鮮豚鼠血
2. 兔紅細胞(RRBC)
實驗步驟

1. AET—RRBC制備
   1) AET溶液的制備
稱取AET粉劑402毫克,溶于10毫升蒸餾水中,使成為0.143M溶液,用4N NaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制,不宜久存。
   2) AET處理RRBC
取洗滌好壓積的RRBC,按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘,每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口(1—2厘米)1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3—5次,每洗一次,必須充分搖勻,以減少AET—RRBC粘附成團,并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象,則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次,后配成10%AET—RRBC懸液,置4℃保存,不得超過5天。
   3) 1%AET—RRBC的配制:
將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC,以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。
2. 從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞,操作見后試驗。
3. AET—E花環(huán)試驗:
將分離的單個核細胞(2ⅹ106/毫升)與等量1%AET—RRBC混合,置37℃水浴15分鐘,每隔5分鐘搖勻一次,分裝數(shù)管,每管2—3毫升,低速離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘)5分鐘后,移至4℃冰箱45分鐘。
4. T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離
將形成E—花環(huán)的細胞懸液,再用淋巴細胞分層液分離,吸取界面云霧狀的細胞,即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底的E—花環(huán),用Hanks液洗一次后,加雙蒸水3毫升處理3分鐘,低滲裂解E—花環(huán)周圍的RRBC,立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升,使還原為等滲,低速離心沉淀,即得富含T淋巴細胞群。

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