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染色質(zhì)免疫沉淀DNA分析

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實(shí)驗(yàn)步驟

1.   交聯(lián)和細(xì)胞收集
1)   取 2 個(gè) 150 cm2培養(yǎng)皿的融合細(xì)胞(每皿細(xì)胞數(shù)約 1 X 107 - 5 X 107 個(gè))。向培養(yǎng)基中滴加甲醛以使蛋白和 DNA 相交聯(lián),甲醛的終濃度為 0.75%(體積百分比),室溫下輕輕搖動(dòng) 10 分鐘。
2)   加入甘氨酸至終濃度為 125 mM,輕輕振蕩孵育 5 分鐘。
3)   用 10 ml 冷 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次。
4)   用 5 ml 冷 PBS 刮下細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至一個(gè) 50 ml 離心管中。
5)   用 3 ml PBS 洗滌培養(yǎng)皿,收集剩余細(xì)胞至 50 ml 離心管中。
6)   1000 g 離心 5 分鐘。
7)   小心吸棄上清液,用 FA 裂解緩沖液重懸沉淀(每 1 X 107個(gè)細(xì)胞加 750 μl)。
2.   超聲
1)   將裂解液超聲處理以使DNA斷裂成約 500-1000 bp 的片段。不同的細(xì)胞系需要不同的超聲時(shí)間,因此需分別進(jìn)行優(yōu)化。
2)   超聲處理后,4 °C,8000 g 離心 30 秒使細(xì)胞碎片沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。此染色質(zhì)溶液將用于步驟 4 的免疫沉淀 (IP)
3)   每個(gè)超聲后的樣本均取 50 μl,此樣本為抽樣樣本,用于定量 DNA 濃度(見步驟 3),并作為 PCR 的對(duì)照樣本。
3.   DNA濃度測(cè)定
1)   抽樣樣本用來測(cè)定 DNA 濃度,為后續(xù) IPs 反應(yīng)提供數(shù)據(jù)。用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(加 70 μl 洗提緩沖液,轉(zhuǎn)至步驟 3.2a)或酚:(加 350 μl 洗提緩沖液,轉(zhuǎn)至步驟 3.2b)來純化 DNA。
2)   加入 2 μl RNA 酶 A (0.5 mg/ml)。置于 65 °C 恒溫振蕩 4-5 小時(shí)(或過夜)以解交聯(lián)。按照 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說明書來純化DNA。樣本可凍存于 -20 °C 冰箱中。
3)   DNA 濃度測(cè)定: 取 5 μl 純化 DNA,加入裝有 995 μl TE 的離心管中,200 倍稀釋,測(cè)定 OD260。根據(jù)公式 DNA 濃度(μg/ml)= OD260 x 10,000,計(jì)算每毫升染色質(zhì)溶液中 DNA 的濃度。
4.   免疫沉淀
1)   使用步驟 2.2 中得到的染色質(zhì)溶液繼續(xù)此操作。建議每個(gè)免疫沉淀反應(yīng) DNA 含量約為 25 μg 。每個(gè)樣本用 RIPA 緩沖液 1:10 稀釋。應(yīng)設(shè)一個(gè)抗體對(duì)照和一個(gè)僅加磁珠的對(duì)照。
2)   除對(duì)照外,其余樣本中均加入一抗。事先應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的抗體加入量。一般來說,每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗體。
3)   所有樣本均加入 20 μl 的 A/G 蛋白磁珠(預(yù)吸附了單鏈魚精 DNA 和牛血清白蛋白,見步驟 4.3a),進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng),4 °C 旋轉(zhuǎn)過夜。
4)   A/G 蛋白磁珠與單鏈魚精 DNA 混合液的制備:如果使用 A 蛋白和 G 蛋白兩種磁珠,應(yīng)將其等體積混合,并用 RIPA 緩沖液洗滌 3 次。吸棄 RIPA 緩沖液,加入單鏈魚精 DNA 至終濃度 75 ng/μl,同時(shí)加入牛血清白蛋白至終濃度 0.1 μg/μl。加入等體積 RIPA 緩沖液,常溫旋轉(zhuǎn)孵育 30 分鐘。用 RIPA 緩沖液洗滌一次,然后加入等體積 RIPA 緩沖液。
5)   將 A/G 蛋白磁珠離心,2000g 1 分鐘,棄上清。
6)   用 1 ml 洗滌緩沖液洗滌磁珠 3 次。2000g 離心 1 分鐘。
7)   用末次洗滌緩沖液洗 1 次。2000g 離心 1 分鐘。
5.   洗提和解交聯(lián)
1)   洗提 DNA:向 A/G 蛋白磁珠中加入 120 μl 洗提緩沖液,30 °C 旋轉(zhuǎn) 15 分鐘。
2)   2000g 離心 1 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。樣本可于 -20 °C 保存。
3)   純化 DNA 可用 PCR 純化試劑盒(見步驟 3.2a)或酚:(加 280 μl 洗提緩沖液,然后參照步驟 3.2b)法進(jìn)行。
4)   DNA 可用實(shí)時(shí) PCR 進(jìn)行定量檢測(cè)??捎脤?shí)時(shí) PCR 儀自帶的軟件進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì),或者使用在線設(shè)計(jì)工具進(jìn)行設(shè)計(jì)。

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