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PCR引物溶解稀釋方法
閱讀:2568 發(fā)布時間:2018-8-7在實驗室進行分子克隆實驗時,經(jīng)常需要合成大量的引物,而這些合成的引物首先要進行適當(dāng)?shù)南♂尣拍苁褂?。如果不稀釋就使用引物,往往造成引物的浪費和過早的活性喪失,更有一些被污染而不能使用。
因此,建議對合成的引物先進行稀釋,然后使用。稀釋的引物利于保存和應(yīng)用。
現(xiàn)將方法簡單敘述如下:
1. Oligo DNA是以O(shè)D260單位來計算的,這是指在1ml體積1cm光程標準比色皿中,260nm波長下吸光度為1A260的Oligo溶液定義為1 OD260單位,根據(jù)此定義,1 OD260單位相當(dāng)于33μg的Oligo DNA,您可以根據(jù)此數(shù)據(jù)和您的Oligo DNA分子量,計算得到摩爾數(shù)以計算不同摩爾濃度的溶液。
2. 引物序列的分子量計算公式如下:
MW=(A堿基數(shù)×312)+(C堿基數(shù)×288)+(G堿基數(shù)×328)+(T堿基數(shù)×303)-61
例如:引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6
MW=(1×312)+(3×328)+(6×303)-61=6541
3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法計算:Oligo DNA中的每個脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5,則一條Oligo DNA的分子量=堿基數(shù)×324.5。
例:
您得到一管標為5 OD260的20 mer Oligo DNA
分子量=20×324.5=6490
質(zhì)量數(shù)=5×33=165μg
摩爾數(shù)=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加滅菌雙蒸水400μl溶解,則濃度為25nmol/400μl=62.5μM
4. 裝有引物的eppendorf管一般保存于-20℃,臨用前稀釋。
5. 由于Oligo DNA呈很輕的干膜狀附在管壁上,打開時極易散失,所以打開管子前請先離心10,000rpm,1min,然后再慢慢打開管蓋。
6. 在裝有引物的eppendorf管內(nèi)加入100-500μl雙蒸水,蓋上管蓋,充分上下振蕩5-10分鐘,再次離心10,000rpm,1min。
7. 計算原引物管primer的濃度(必要時測OD260核對廠家提供引物量是否正確)。
8. 計算并將應(yīng)用primer稀釋為10pmol/μl。
9. 標明原引物管、應(yīng)用引物管、稀釋方法,置-20℃保存。