實驗方法原理    小腦顆粒神經(jīng)元的體外培養(yǎng)受取材部位、特殊培養(yǎng)條件等因素的影響，易于獲得純度較高的培養(yǎng)物。該細(xì)胞為雙極突起，常用來研究神經(jīng)突起的生長。其培養(yǎng)條件具有高濃度鉀離子依賴特性，常用來作為誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的研究模型。當(dāng)成熟顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)液由高KCl(通常是25-30mmol/L)換為低KC!(基本培養(yǎng)液中已含5mmol/L KCl)時，細(xì)胞會逐漸發(fā)生凋亡。
實驗材料    新生7d的SD大鼠仔鼠
試劑、試劑盒    10%胎牛血清+DMEMNeurobasal+B27KCl
儀器、耗材    培養(yǎng)瓶
實驗步驟    
原代培養(yǎng)來自于新生7d的SD大鼠小腦顆粒神經(jīng)元，可參考Moreno-Flores的方法，此方法培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元純度達(dá)到95%以上。具體操作過程如下。

1.首先依照總論的方法獲得細(xì)胞懸液，然后在離心獲得的細(xì)胞沉淀中，加入少量的*培養(yǎng)液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重懸細(xì)胞，再根據(jù)細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果補加適的*培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)目的按照合適的密度接種細(xì)胞于多聚賴氨酸包被的介質(zhì)上，37℃,5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)第4天1/2量換液，至第7天細(xì)胞基本成熟。小腦顆粒神經(jīng)元胞體小，接種后約24h,開始伸出突起，突起易成束生長。圖I-2示接種48h后細(xì)胞生長情況。

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注意事項    
1.在原代取材時，由于取材部位和仔鼠體積的原因，通常將消過毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中，直接用解剖器械取出完整的小腦，不做斷頭處理。

2.小腦的腦膜不易剝離干凈，要特別仔細(xì)去除，否則培養(yǎng)物中成纖維細(xì)胞的污染難以去除。

3.由于培養(yǎng)細(xì)胞的目的不同，接種時的密度就有區(qū)別。如用于神經(jīng)突起觀察，可接種(1-3)x105/cm2的密度；如用于凋亡誘導(dǎo)的研究，可接種(4-6)x105/cm2的密度。

4.在做凋亡誘導(dǎo)時，通常將含高鉀的培養(yǎng)液全量換液為不含額外添加KCl的普通Neurobasal+B27培養(yǎng)液即可。按照核固縮判斷的方法，8h后凋亡的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)40%左右。
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其他    
1小腦顆粒神經(jīng)元胞體小，突起細(xì)長，且容易成束生長，個人感覺該細(xì)胞可做突起生長的大致觀察，并不適合利用軟件分析突起長短。神經(jīng)元一般3-4d突起就可長好，可開始觀察。

2.在體外培養(yǎng)7d左右待細(xì)胞成熟后，可以開展凋亡實驗。如添加保護劑抑制凋亡，應(yīng)注意誘導(dǎo)凋亡的時間不可過長，否則可能導(dǎo)致保護實驗失敗。