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新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)實驗

閱讀:237          發(fā)布時間:2018-12-19
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實驗方法原理    將大鼠的心肌細胞從機體中取出,經(jīng)胰酶、螯合劑(常用EDTA)處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖。
實驗材料    SD 乳鼠
試劑、試劑盒    低糖 DMEM、胰酶 EDTA青鏈霉素碳酸氫鈉液新生牛血清谷氨酰胺D-Hank's 液新潔爾滅碘酒酒精
儀器、耗材    鋁盒眼科直剪眼科彎剪眼科直鑷眼科彎剪玻璃培養(yǎng)皿 廣口瓶棉球燒杯 錐形瓶離心管磁力攪拌器攪拌子水浴振蕩器尼龍篩網(wǎng)針式濾器
實驗步驟    
一、實驗材料準備 
 
1.  動物
 
出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。
 
2.   試劑
 
低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精,培養(yǎng)液(DMEM,新生牛血清,青鏈霉素)。
 
3.   手術器械和儀器
 
鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿(共 2 套,一套用于解剖取材,另一套用于剪碎心臟組織)、100 ml 廣口瓶兩個(分別裝碘酒和酒精棉球)、500 ml 燒杯、250 ml 錐形瓶、15 ml和 50 ml 的離心管,磁力攪拌器和攪拌子(或者水浴振蕩器)、150-200 目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。
 
二、方法
 
1.   將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度,并放置于 37℃水浴中溫育好。
 
2.  解剖取材:將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出,用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚,再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部,右手取一把眼科直剪剪開皮,充分撕拉開,再用酒精棉球消毒后,取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨,然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂,乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下,放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復以上過程。取材完畢后,撤掉取材的手術器械。

注:為了保證心肌細胞的活力,取心的操作過程盡量快,另外,把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺上或者預冷的平衡鹽液中。
 
3.   用第二套手術器械進行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉,放在另一個預先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中,把心臟組織再洗一遍后,將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中(或者其它合適容器中,視個人習慣),加少許 0.06%胰酶,用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊,將剪碎的心臟和胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中,另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中,補加胰酶至終體積10 ml,加上塞子,放在 37℃水浴中(可以用一個消毒的500 ml燒杯,裝好無菌的蒸餾水,加夠水量,水位線稍低于250 ml錐形瓶的刻度線即可,過少則溫度會不均勻,過高容易污染。打開磁力攪拌器電源,預先將水溫調(diào)節(jié)到 37℃),調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 rpm左右,消化15 min(務必保證水浴溫度恒定在 37℃,并且消化時間不超過 15 min)。或者,如果采用的是水浴震蕩器的話,不用加攪拌子,直接放在水浴震蕩器中消化亦可,轉(zhuǎn)速和消化時間相同。
 
4.  從水浴中取出錐形瓶,小心吸去上清,上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。
 
5.    加入10 ml 新的胰酶,用一支新的吸管吹打溶液幾次,機械分散細胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀),注意:不要過分吹打,否則會導致組織過度消化,37℃水浴攪拌再消化 10-15 min;如果乳鼠數(shù)目少(比如 5、6 只的時候),消化時間可以減少為 5-10 min,否則很容易消化過度。上述消化處理的同時,往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預冷的含 10%血清的培養(yǎng)液,并放置冰臺上。消化處理之后,小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中,次消化收集的分離出的細胞,次消化結束后;繼續(xù)第二次消化,余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。
 
6.  重復 5 消化步驟,直至剩余少許組織塊為止,一般消化 4-5 次可以消化絕大多數(shù)的組織塊(不含棄去消化液的那次)。
 
7.  第 1、2 次含細胞的消化液放在一根離心管中,過 180 目篩網(wǎng)后,一起離心;第 3、4 次含細胞的消化液放在一根離心管中,過 180 目篩網(wǎng)后,一起離心。后,分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細胞,接種到一個 75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中,放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時后,取出,棄貼壁細胞(主要是成纖維細胞和內(nèi)皮細胞),將未貼壁的細胞懸液取出,臺盼籃拒染法計數(shù)后,加入培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5-6x105個/ml,接種到目的培養(yǎng)器皿中。
 
5.    一般不用加BrdU,如果培養(yǎng)時間長(發(fā)現(xiàn)成纖維細胞也極少),可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU,心肌細胞搏動的持續(xù)時間會更長。
 
9.    接種后 24 小時,用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細胞一次,以去處未貼壁的細胞(部分細胞會在 24 小時后貼,結果很多細胞重疊生長),再更換培養(yǎng)液,即可??梢园凑諏嶒炐枰谂囵B(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。
 
三、 結果
 
心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形,大約在 24 h左右基本貼壁,此時細胞伸出偽足,偽足在鏡下為纖維狀條索,細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,如多角形,部分細胞有聚集傾向,細胞搏動效果較好, DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色,兩天后變?yōu)榈S色,應該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn),也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充。鑒定的簡單的辦法就是搏動與否,注意:當搏動比較微弱的時候,在 10 倍物鏡下可能看不到搏動,換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外,心肌細胞表達肌動蛋白,可以作為鑒定,但不是的特征性指標,因為平滑肌細胞也表達。
 
 
 
收起 
注意事項    
乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞,培養(yǎng)過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度胰酶消化方法,0.06%濃度的胰酶對細胞損害較小,但這個濃度消化所需時間較長。采取多次反復低濃度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同,采用差速貼壁 1.5 h,充分去除成纖維類細胞,達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長時呈放射狀,并且會增殖,不搏動,很好和心肌細胞鑒別。消化和吹打一定不要過度,是保證心肌細胞活力重要的一個原則。而接種密度(一般不低于 105/ml),也將影響到心肌細胞的搏動及同步化搏動。
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其他    
一、實驗討論

乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞,培養(yǎng)過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度胰酶消化方法,0.06%濃度的胰酶對細胞損害較小,但這個濃度消化所需時間較長。采取多次反復低濃度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同,采用差速貼壁 1.5 h,充分去除成纖維類細胞,達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長時呈放射狀,并且會增殖,不搏動,很好和心肌細胞鑒別。消化和吹打一定不要過度,是保證心肌細胞活力重要的一個原則。而接種密度(一般不低于 105/ml),也將影響到心肌細胞的搏動及同步化搏動。

心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形,大約在 24 h左右基本貼壁,此時細胞伸出偽足,偽足在鏡下為纖維狀條索,細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,如多角形,部分細胞有聚集傾向,細胞搏動效果較好, DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色,兩天后變?yōu)榈S色,應該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn),也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充。鑒定的簡單的辦法就是搏動與否,注意:當搏動比較微弱的時候,在 10 倍物鏡下可能看不到搏動,換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外,心肌細胞表達肌動蛋白,可以作為鑒定,但不是的特征性指標,因為平滑肌細胞也表達。

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