方 案 2. 11 通 過 焚 光 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué) 分 析 h E S 細(xì) 胞 的 特 性

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ 生 長(zhǎng) 于 0.1 % 明膠包被的玻璃蓋玻片上的h E S 細(xì)胞

非無菌

□ 4 % 多聚甲醛

□ P B S A

□ T ris-緩 沖 鹽 溶 液（T B S 一）

□含有 0.5 % T r i t o n X -100 的 Tris-緩 沖 鹽 溶 液（T B S + )

□ 奶 粉 ， 5 % W /V ，去 離 子 水（d H 20 ) 配制

□ 一抗； S S E A -1、 -3、 -4、 T R A -1-60、 -1-81 及 0 C T -4

□適宜的二抗

□ 封 片 劑 ，如 Fluorosave

□吸氣器和吸液管

□鋁箔

□紙板染色盤

□ 可 置 于 2 4 孔板的玻璃蓋玻片

□ 平 板 搖 床（可選擇）

□熒光顯微鏡和相機(jī)

步驟

第 1 天

(a) h E S 細(xì)胞可生長(zhǎng)于M E F 伺養(yǎng)層細(xì)胞上一起染，因 為 M E F s 不會(huì)表達(dá) 任 何 hES細(xì)胞的標(biāo)志物。一個(gè)24孔板要接種5 X IO⁵ 個(gè)經(jīng) C 滅 活 的 M E F s ，種 在 0.1 %明膠包被的13m m 玻璃蓋玻片上，如 前 所 述（方 案 2. 5)。

(b ) 在固定之前， h E S 細(xì)胞要 傳 代 至 有 M E F 細(xì) 胞 的 蓋 玻 片 上 生 長(zhǎng) 2?3 天 ，以使細(xì)胞貼附并生長(zhǎng)成單層，每一種抗體至少要用兩孔h E S 細(xì)胞進(jìn)行染色。

(c) 從生長(zhǎng)著 h E S 細(xì)胞的蓋玻片上吸去h E S 培養(yǎng)基，用 500W P B S A 洗一次。

(d ) 用 4 % 的多聚甲醒固定30 —— 4 0 m i n 。

(e) 吸去固定液，用 5 0 0 4 P B S A 洗一次。

(f) 每孔加 人 500f i l T B S + , 室 溫 孵 育 15m i n , 放在平板搖床上搖，吸液時(shí)要小心 ，不要碰掉細(xì)胞。

(g ) 吸去 T B S + , 重 復(fù) 步 驟（f) 4?5 遍 ，以保證細(xì)胞被*清洗。 T B S + 也使細(xì)胞滲透性增加，使抗體染色更充分。

(h ) 清洗結(jié)束時(shí)，用 500ul 溶 解 于 去 離 子 水 的 5 % 奶 粉 溶 液 孵 育 細(xì) 胞 30?60m i n ，以阻斷非特異性的抗體結(jié)合。

(i) 在此孵育過程中，根據(jù)供應(yīng)商的提示，用 5 % 奶粉溶液稀釋好一抗。

(j) 吸去奶粉溶液，重 復(fù) 洗 的 步 驟（f) 4?5 次 ，已保證除去所有非特異性結(jié)合的抗體。

(k ) 每 孔 用 250?500M 1相應(yīng)的一抗 5 % 奶粉溶液孵育，室溫過夜。放在平板搖床上搖，或者要確認(rèn)細(xì)胞已被浸沒。

注意：加液和吸液時(shí)要小心謹(jǐn)慎，以避免抗體的交叉污染。

第 2 天

(a) 吸去一抗溶液，每一種抗體用不同的吸頭以避免交叉污染。

(b ) 用 T B S — 洗細(xì)胞，每 孔 500m 1。

(c) 用 T B S 醉育細(xì)胞，每 孔 500jlJ , 15m i n ，放在平板搖床上。

(d) 吸 去 T B S ‘ ，重 復(fù) 步 驟（c) 4?5 遍 ，以保證除去一抗。

(e) 在清洗孵育過程中，可 用 TBS+ 配制相應(yīng) 的 二 抗 ，每 孔 需 要 250? 500ul抗體一T B S 1溶液 ，根據(jù)是否使用平板搖床來決定加的量（250ul 或 500ul)。

注意：如果使用 D N A 熒光染色顯示核，要在這時(shí)閱讀步驟（g )。

(f) 清洗結(jié)束時(shí)，吸 去 T B S - 溶 液 ，每 孔 加 250?500ul抗體-T B S + 溶液孵育細(xì)胞，放在平板搖床上，室溫孵育至少 l h 。

(g ) Hoechst 33258或 D A P I 可用于顯示 h E S 細(xì)胞的核，可能要以適宜的濃度加人到二抗溶液中，可與二抗溶液一起孵育。

(h ) 用相應(yīng)的封片劑封片，如 Fluorosave。

(i) 用熒光顯微鏡和照相設(shè)備觀察之前，要讓片子*干燥。

注意：所有 的 二 抗 以 及 用 二 抗 孵育的板都要用鋁箔包 起 來 ， 以 防 被 日 光 漂 白 。

方 案 2. 12 R T -P C R 合 成 h E S 細(xì) 胞 的 c D N A

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ 幾 小 塊 h E S 細(xì)胞集落，按照與常規(guī)傳代相同的方法制備（見 2. 5. 1. 2 節(jié)

非無菌

□ R N A 提取試劑盒，如 R N A e a s y

D 5 X A M V - R T Superscript e n z y m e

□ 緩 沖 液 ：含 10m m o l / L M g C l 2 的 A M V - R T

□ 引 物 ： oligo (d T )I8, 2ug/ul

□ 引 物 ： oligjj C d N >i。， 2ug/ul

□ 核 苷 ： d N T P s ， 2m m o l / l

□核糖核酸酶抑制劑 ： R N a s i n

□ 模 板 ：提 取 的 R N A ， 2ug

□ 無 R N A 酶的水

□ 設(shè) 置 在 70°C 的加熱塊

□ P C R 熱循環(huán)儀

□加樣器和吸頭

□冰

步藤

(a) 使 用 R N A 提取試劑盒，按照制造商的說明書從 h E S 細(xì)胞制備 R N A 模板

(b ) 準(zhǔn) 備 R T -P C R 的預(yù)混液：

d N T P s , 2m m o l / L 1ul

方 案 2. 13 通 過 P C R 分 析 h E S 細(xì) 胞 的 基 因 表 達(dá)

試劑與材料

無菌或無菌制備

□ 幾 小 塊 h E S 細(xì)胞集落，按照與常規(guī)傳代相同的方法制備（見 2. 5. 1.2 節(jié)）。

非無菌

□10XTaq 緩沖液（標(biāo)準(zhǔn)液是 25 mmol/L MgCl2）

□ T a g D N A 多聚酶

□ d N T P s ， 2m m o l / L

□ R T -P C R 合 成 的 c D N A 模板

□ 高 壓 消 毒 的 d H 20

□瓊脂粉

□溴化乙啶

□ 5 X 上樣染料

i v ) 將一個(gè)梳子放人 P C R 膠的模具中，將熱的混合物輕緩地灌人。注意不要產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)妨礙 D N A 在膠中的遷移。

V) 拔 梳 前 置 室 溫 30m i n , 使膠冷卻直至凝同，放在電泳 槽 中 ，以 50m m o l / L溴化乙啶緩沖液覆蓋之。

(d ) P C R 循環(huán)完成后，將樣品從循環(huán)儀中取出。

(e) 每個(gè)樣品中加 5M 1 上樣染料，將樣品加至膠中，確認(rèn)同時(shí)加了 肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性對(duì)照樣品以及 D N A 梯形標(biāo)準(zhǔn)品。

(f) 開始電泳， 100V ， 30?40m m , 直 到 D N A 梯形標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)清楚地分開，在紫外燈下很容易區(qū)分。

(g ) 用 一 個(gè) U V -透 視 器（波 長(zhǎng) 315n m ) 看 膠 ，如果需要，用相機(jī)拍照。

(h ) 將每一個(gè)樣品的所有 D N A 片 段 與 D N A 梯形標(biāo)準(zhǔn)品相比較，觀察是否有預(yù)期的 帶（前已述及），（3-肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性對(duì)照樣品也要被證實(shí)已經(jīng)顯示。

(i) 預(yù)期大小的 D N A 條帶可以用洗膠試劑盒（如 G E N E C L E A N ® ) 很容易提取出來 ，并且應(yīng)該通過測(cè)序來證實(shí)