實驗方法原理

取材于出生2~3 d 小鼠顱骨，以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，采用膠原酶消化法分離成骨細(xì)胞，并進行細(xì)胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞是一種可靠、簡便、快速的細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法。

實驗材料SD大鼠

試劑、試劑盒F12 *培養(yǎng)液胰蛋白酶Ⅱ型膠原酶酒精

儀器、耗材手術(shù)器械磁力攪拌器

實驗步驟

一、實驗步驟

1.  拉頸處死24 小時內(nèi)新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出頭蓋骨，分離頂骨和額骨，冰生理鹽水液反復(fù)洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標(biāo)本除去脂肪組織及殘留血，放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌， 將顱骨剪成2～5 mm2 碎片，將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預(yù)消化15 min，以清除纖維組織細(xì)胞，棄去上清液(其中主要含成纖維細(xì)胞)。

2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml，在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘，室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘，收集消化液，室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細(xì)胞，接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中，補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml；對靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘，將獲得的3 瓶細(xì)胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在5% CO2，95%空氣，37℃溫度下培養(yǎng)，24 小時后可見細(xì)胞貼壁生長，胞質(zhì)開始伸展，換新鮮培養(yǎng)液，以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注：消化視具體情況而定，也可多消化 1 遍)。

3.  原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿。傳代時，取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細(xì)胞 1 瓶，棄去培養(yǎng) 液，傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室溫下消化3～5 分鐘，將胰蛋白酶液棄去，加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細(xì)胞收集、合并，計數(shù)；用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細(xì)胞進行實驗。代數(shù)太多，細(xì)胞老化或者分化明顯。

二、結(jié)果

如圖所示，成骨細(xì)胞的形狀和成纖維細(xì)胞非常相似，但是不同的是，比成纖維細(xì)胞更不容易消化，尤 其是傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化的時候，非常難消化，并且不易消化成單個細(xì)胞。

圖1：成骨細(xì)胞

圖2：成骨細(xì)胞100倍
 

圖3：成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)

三、鑒定的方法

1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測

3.  礦化結(jié)節(jié)檢測

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注意事項

1. 自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。

2. 在超凈臺中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。

3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細(xì)菌落入。

4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。

5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

6. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理。

8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

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其他

一、討論

成骨細(xì)胞包繞在硬組織中，致使處理困難，可采用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織塊法、 骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng) EDTA 處理并經(jīng)膠原酶消化，均可培養(yǎng)出成骨細(xì)胞。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞保持 有骨組織細(xì)胞的某些特征。據(jù)文獻報道，不同方法培養(yǎng)的成骨細(xì)胞形態(tài)是不同的[1]。

二、文獻

[1]  司徒鎮(zhèn)強. 細(xì)胞培養(yǎng) [M]. 版. 西安. 世界圖書出版社西安公司, 2000:115.