實(shí)驗(yàn)步驟    
方 案 2. 6 人 胚 胎 干 細(xì) 胞 系 的 建 立

試劑與材料

無(wú)菌或無(wú)菌制備

□ 5?6 天的人胚泡，經(jīng) H F E A 允許，并且像先前討論的*經(jīng)病人同意。 HFEA所要求的全部細(xì)節(jié)能夠在 H E F A 的網(wǎng)站找到

□鏈霉蛋白酶， 0 . 5 % ，溶 于 DMEM

□ 抗 人 抗 體 ， 3 0 % ?5 0 %

□含有 Glutamax 的 DMEM

□ h E S 培 養(yǎng) 基（見 2. 2. 1 節(jié)）

□豚鼠的補(bǔ)體，用 DMEM I : 1 稀釋

□ 4 孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔以 7.5X 104 的細(xì)胞數(shù)接種新的失活的 M EFs，含 有 500ulHES 培養(yǎng)基

□大孔吸管

步驟

(a) 使胚胎生長(zhǎng)到胚泡階段，通常大約 5 天。

(b) 如果胚胎沒有從透明圈里孵出，用 5?IOuI 的 0 . 5 % 鏈霉蛋白酶在 37°C 孵育直到透明圈溶解。

(c) 將無(wú)透明圈的胚泡與抗人抗體孵育 i 〇 min，此抗體用含Glutamax 的 DMEM稀 釋 3 0 % ?5 0 % 。

(d) 在孵育之后，用 h E S 培養(yǎng)基短暫地沖洗胚泡使抗人抗體失活。

(e) 用 5?IOmI 2 0 % 的豚鼠補(bǔ)體與胚泡在 37T：孵 育 5?15 min, 目的是溶解胚胎滋養(yǎng)層，此時(shí)用大孔吸管輕輕吹吸胚胎將有助于溶解過(guò)程。

(f) 當(dāng)胚胎滋養(yǎng)層*溶解，用吸管輕輕地取出完整的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)并立即轉(zhuǎn)移到含有 500ul h E S 培養(yǎng)基的 M E F s 培養(yǎng)板上。

(g) IC M 細(xì) 胞 2?5 天內(nèi)將貼壁，要每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)。要在原位 停 留 1 5 天以上 ，如果需要，可以添加新的滅 活 的 MEFs (只有當(dāng)集落大到足以傳代時(shí)才能將它轉(zhuǎn)到新 的 M E F s 培養(yǎng)板上）。

(h) 從 ICM 來(lái)源的細(xì)胞具有類干細(xì)胞的形態(tài)，通常出現(xiàn)在集落的中心。

(i) 當(dāng)克隆達(dá)到約 0_1?0.5 mm 大小時(shí)，用拉長(zhǎng)的玻璃吸管將它們切割成 2?10小塊并轉(zhuǎn)移到 2?4 孔新的失活的 M E F s 培 養(yǎng) 板 中（見 方 案 2.7)。這個(gè)過(guò)程每 5?7 天重復(fù)一次。

(j) 在新建立的 h E S 細(xì)胞系前幾次傳代之后， h E S 細(xì)胞的增殖就可按以下方案進(jìn)行(見 2.5 節(jié)）。

注意： 一旦超過(guò)單一集落，初 建 的 h E S 細(xì)胞系的團(tuán)塊每一代都要凍存直到獲得了大量?jī)龃娉晒Φ膬龃婀埽ㄒ?2 . 6 節(jié)）。 前 10?1 5 代 少 5 0 % 的細(xì)胞將被凍存直到細(xì)胞系被很好的建立。