Seamless Cloning Kit（無縫克隆試劑盒）

Seamless Cloning Kit（無縫克隆試劑盒）是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進(jìn)行同源重組的基因克隆試劑盒。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶（5' Exonuclease）、DNA聚合酶（DNA Polymerase）和DNA連接酶（DNA
Ligase）活性的重組酶（assembly enzyme），通過同源重組的方法可以將一個(gè)或多個(gè)DNA片段按照預(yù)定方向、快速、高效

 上海雅吉生物的Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進(jìn)行同源重組的基因克隆試劑盒。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA
Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme)，通過同源重組的方法可以將一個(gè)或多個(gè)DNA片段按照預(yù)定方向、快速、高效和精確
地插入到線性化載體中，并且zui終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此被稱作“無縫克隆”。
      和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無縫克隆方法有多方面的突出優(yōu)點(diǎn)：(1) zui終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此是真正的"無縫克隆"；(2) 可通過一個(gè)反應(yīng)將一個(gè)或多個(gè)片段快速、定向地插入到載體的任何位置；(3) 待插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無須酶切；(4) 插入片段的大小范圍寬，從20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5) 可通過PCR擴(kuò)增獲得線性化載體，因此限制性內(nèi)切酶消化并不是克隆所必須的；(6) 酶催化的重組連接反應(yīng)非?？焖俸透咝В瑢?duì)于一個(gè)片段的插入僅需50℃處理15分鐘；對(duì)于三個(gè)片段的插入僅需50℃處理30分鐘，而對(duì)于5個(gè)片段的插入也僅需50℃處理約60分鐘；(7) 只有插入片段和線性化載體的末端才能發(fā)生同源重組，可以有效避免非特異性的同源重組；(8) 陽性克隆比例高，單個(gè)DNA片段克隆的陽性率幾乎為100%，三個(gè)片段的克隆陽性率約為70-80%。
      本無縫克隆試劑盒操作非常簡(jiǎn)單。本試劑盒進(jìn)行基因克隆時(shí)沒有酶切位點(diǎn)的限制，僅需在載體的預(yù)定克隆位點(diǎn)通過酶切進(jìn)行線性化或通過PCR的方法直接制備線性化的載體，在插入片段的兩個(gè)PCR引物的5' 端引入與載體克隆位點(diǎn)兩端**的
15~25bp的重疊序列。重組反應(yīng)可以在50℃快速進(jìn)行，3-4小時(shí)內(nèi)即可完成從DNA樣品的PCR擴(kuò)增、純化、重組、到轉(zhuǎn)化涂板的全部操作。其中PCR反應(yīng)約2-3小時(shí)，PCR產(chǎn)物純化約20分鐘，重組反應(yīng)15分鐘，轉(zhuǎn)化涂板約40分鐘，共計(jì)約3-4小時(shí)即可完成。
      無縫克隆試劑盒的工作原理示意圖請(qǐng)參考圖1。

 圖1. 無縫克隆試劑盒的工作原理圖。重疊區(qū)域(overlap region)的DNA序列**，通常長(zhǎng)度為15-25bp。不同顏
色的重疊區(qū)域代表不同的重疊序列。在插入2個(gè)或以上片段時(shí)，不同的重疊序列可以確保待插入片段有序地插入到線性化的載體(linearized vector)中。
      Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)用于一個(gè)1100bp片段的克隆和三個(gè)不同的1100bp片段的克隆，其重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板獲得的LB平板的實(shí)測(cè)效果參考圖2A，菌落PCR鑒定結(jié)果參考圖2B。

 

圖2. 本試劑盒用于無縫克隆的實(shí)測(cè)效果。A. 本試劑盒反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α后涂板獲得的LB平板效果圖。在20μl反應(yīng)體系中，將雙酶切線性化的載體pUC18 (Linearized pUC18)，與通過PCR擴(kuò)增的含有重疊序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:3)；或者與3個(gè)有適當(dāng)重疊序列的不同的1100bp片段混合，pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:1:1:1，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix，并用水補(bǔ)至20μl，50℃反應(yīng)15min(插入一個(gè)片段)或
30min(插入三個(gè)片段)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物放置在冰上5min，取5μl轉(zhuǎn)化到100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌中。對(duì)照組中只加入線性化的載體pUC18，同時(shí)也在50℃反應(yīng)15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，插入片段數(shù)目越多轉(zhuǎn)化后得到的克隆數(shù)越少。B.菌落PCR鑒定用本試劑盒構(gòu)建得到的克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，插入1個(gè)片段時(shí)的陽性率基本上為100%，插入3個(gè)片段時(shí)的陽性率約為70%左右。
包裝清單：

產(chǎn)品編號(hào)    產(chǎn)品名稱    包裝
D7010S-1    2X Seamless Cloning Mix    200μl
D7010S-2    Linearized pUC18 (50ng/μl)    10μl
D7010S-3    DNA fragment (1100bp, 60ng/μl)    10μl
D7010S-4    Nuclease free water    200μl
—    說明書    1份
保存條件：
      -20℃保存，一年有效。
Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)注意事項(xiàng)：
      單個(gè)片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，如果PCR條帶單一，可以無須純化并直接進(jìn)行重組反應(yīng)，但PCR產(chǎn)物的體積不得超過重組反應(yīng)體系的20%，并且重組效率通常會(huì)低于純化后的PCR產(chǎn)物。
      對(duì)于多個(gè)片段的重組反應(yīng)，重組效率通常會(huì)低于單個(gè)片段的重組效率，建議膠回收純化后再進(jìn)行重組反應(yīng)。對(duì)于3個(gè)以上片段的重組反應(yīng)或重組片段大于5kb時(shí)，強(qiáng)烈建議在膠回收后再進(jìn)行重組反應(yīng)。通常膠回收后，重組效率可提高2-10倍。
      單片段和線性化載體重組時(shí)，摩爾比至少為2:1。多片段和線性化載體重組時(shí)，各個(gè)片段和線性化載體的摩爾數(shù)宜保持*。
      Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。