豬流感病毒甲型H1N1 RT-PCR檢測試劑盒

豬流感病毒甲型H1N1 RT-PCR檢測試劑盒豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病
毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大，
所以及早確診對該病的防治具有特別重要的意義。豬流行性腹瀉病毒的傳統(tǒng)診
斷方法主要有病毒的分離鑒定、免疫熒光抗體試驗、免疫電鏡觀察和 ELISA
等方法。但這些方法操作過程繁瑣、操作難度大，所需要時間較長，專一性不
強因此建立一種快速、高靈敏度的診斷方法對防治 PEDV 感染是十分必要的。
豬流感病毒甲型H1N1 RT-PCR檢測試劑盒就是針對這一需求開發(fā)的實時定量 RT-PCR 產品，它具有下列特點：
1. 靈敏度高，分析靈敏度可以達到 50 拷貝/uL，遠高于常規(guī)方法，也比常
規(guī)的 RT-PCR 檢測高 100 倍。
2. 特異性高，根據 PEDV 的 ORF3 基因保守區(qū)設計引物，不會誤檢其他豬
的病原性病毒（如豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒、豬傳染性胃腸炎、豬繁殖與
呼吸綜合癥病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬瘟病毒等）。
3. 一管封閉式，避免了 RT-PCR 產物對后續(xù) RT-PCR 的污染。
4. 線性范圍廣，在 10-107拷貝/uL 的靶分子濃度范圍內均呈線性。
5. 簡單快捷，只需要 2 小時即可得到實驗結果。
規(guī)格及成分 成 份 50 次塑料袋包裝
即用型熒光 RT-PCR Mix 750 uL
PEDV 專一性引物對 100 uL
PEDV 陽性對照（XXX 拷貝/uL） 50 uL
超純水 1 mL
使用手冊 1 份

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑 樣品。
使用方法 一、樣品 RNA 的制備
用自選方法純化 PEDV 樣品的 RNA，也可以另購本公司的病毒 RNAout
或柱式病毒 RNAout，上述兩款產品跟本試劑盒兼容。
二、制備 PEDV 標準曲線
1. 標記 6 個離心管，分別為 1,2,3,4,5 和 6 號。
2. 用帶芯分別加入 45 uL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 1 號管中加入 5 uL PEDV 陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘。
4. 換槍頭，從 1 號管中取 5 uL 溶液到 2 號管中，充分震蕩 1 分鐘。
5. 換槍頭，從 2 號管中取 5 uL 溶液到 3 號管中，重復上面的操作直到得到
6 個稀釋度的樣品。
6. 從 6 個管中分別取 5 uL 進行定量 RT-PCR（見下步），每個樣品zui重
復 3 次。
三、熒光定量 RT-PCR 反應（30 uL 體系）
7. 在 PCR 管中加入下列成分（每個樣品zui重復三次，這里只列出一次）：
成 份 樣品
6 個陽性對照（見制
備 PEDV 標準曲
線）
陰性對照
PEDV 專一性引物對 2 uL 2 uL 2 uL
樣品 RNA 5 uL 無 無
PEDV 陽性對照（XXX 拷
貝/uL）
無
5 uL（每個管加一
個稀釋度的對照） 無
自備 1×ROX (見注) 2 uL 2 uL 2 uL
補超純水到 15 uL 15 uL 15 uL
即用型熒光 RT-PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL
注：僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光
PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、
RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。
此處陰性對照用的是水，用戶也可以用其他 RNA 做陰性對照。
8. 輕柔混勻后上機，按下面參數進行定量 RT-PCR，反應參數如下：
過程 溫度 時間 其他
RT（逆轉錄） 42℃ 5 分鐘
預變性 95℃ 2 分鐘
PCR 反應
（40 個循環(huán)）
94℃ 15 s
62℃ 25 s
收集熒光數據，所
選擇波長見注。
溶解曲線分析判斷產
物特異性
加熱到 95℃ 10 分鐘，然后降低到 55℃后，
按 0.5℃/10s 的升幅將溫度提高到 95℃，
其間記錄下熒光信號的變化。特異的 PEDV
PCR 擴增產物將在 82.2℃產生特異峰。
注：本產品所用熒光染料跟 RNA 結合時的zui大光吸收是 500 nm，zui大發(fā)射
波長是 530 nm，不同 PCR 產物（DNA 段）結合時zui大吸收波長是 471 nm，
無發(fā)射。
四、數據處理
9. 以 PEDV 陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。
再用濃度的的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值反推出
樣品 RNA 的濃度。
關聯(lián)產品 豬傳染性胃腸炎病毒 RT-PCR 試劑盒（CAT#：11-210）