人黑色素瘤標記物（MART）Elisa試劑盒

人黑色素瘤標記物（MART）Elisa試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法（Sandwich ELISA）檢測樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標準品或樣品時，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合。當加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復合物

人黑色素瘤標記物(MART)Elisa試劑盒是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

4.2 結(jié)合物
人黑色素瘤標記物(MART)Elisa試劑盒結(jié)合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中zui關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

4.2.1 酶
用于ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格便宜，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。zui在受檢標本中不存在相同的酶。另外，它的相應底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等
在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有zui高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應注意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進行試驗。
國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，zui適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。

4.2.2 抗原和抗體
人黑色素瘤標記物(MART)Elisa試劑盒制備結(jié)合物時所用抗體一般均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。zui用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結(jié)果本底淺淡。如用F(ab')2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。

4.2.3 結(jié)合物的制備
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸酶一般用此法進行標記。交聯(lián)方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達60%-70%）和重復性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其*比例為：酶/抗體=1~2/1。此法簡便有效，一般認為是HRPzui可取的標記方法，但也有人認為所用試劑較為強烈，各批實驗結(jié)果不易重演。 
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法zui為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得*的分離效果，但費用較貴。
結(jié)合物制得后，在用作人黑色素瘤標記物(MART)Elisa試劑盒前尚需確定其適當?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的*靈敏度，達到zui合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的zui高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發(fā)生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。