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人抗肝可溶性抗原抗體(SLA)Elisa試劑盒的基本組成
規(guī)格：48次、96次
使用目的：血清、血漿及相關(guān)液體樣本
標(biāo)本要求
1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
免疫吸附劑
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。
4.1.1 固相載體
固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。
ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常用，于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質(zhì)軟板薄，可剪割、價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別zui大這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。
人抗肝可溶性抗原抗體(SLA)Elisa試劑盒在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點的暴露面處于*反應(yīng)狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌*，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，zui后直接放入分光光度計中比色。
也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點是表面積極大，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。
包被的方式
將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用力。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合?？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉?jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。
脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
人抗肝可溶性抗原抗體(SLA)Elisa試劑盒包被用抗原
獸藥殘留檢測大部分藥物因分子量小，難于直接吸附于固相載體上，因此需要將小分子藥物經(jīng)過改造成合適的半抗原，再將半抗原與大分子的載體蛋白偶聯(lián)（通常是利用半抗原分子中含有一定數(shù)量的游離基團(tuán)，如巰基、氨基、醛基、羧基、酮基、苯酚基、咪唑基等，這些基團(tuán)可與蛋白質(zhì)分了中的對應(yīng)基團(tuán)在偶聯(lián)劑的作用下發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)），從而形成半抗原-載體蛋白復(fù)合物，半抗原-載體蛋白復(fù)合物通過載體蛋白吸附到固相載體上，實現(xiàn)小分子藥物的包被過程。常用的載體蛋白有： 牛血清白蛋白(BSA) 、人血清白蛋白（HSA）、牛的免疫球蛋白（TRP）、雞的卵清蛋（OVA）、血藍(lán)蛋白（KLH）等。
臨床用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。Ｖ亟M抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。
4.1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)（即便是極微量的），在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當(dāng)稀釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時應(yīng)注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。
結(jié)合物
結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中zui關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤诮Y(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。
酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格便宜，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等
在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有zui高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力。高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進(jìn)行試驗。
國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，zui適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。
抗原和抗體
制備結(jié)合物時所用抗體一般均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底淺淡。如用F(ab')2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。
4.2.3 結(jié)合物的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸酶一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其*比例為：酶/抗體=1~2/1。此法簡便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所用試劑較為強(qiáng)烈，各批實驗結(jié)果不易重演。
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法zui為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得*的分離效果，但費用較貴。
結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護(hù)一個低的本底，并獲得測定的*靈敏度，達(dá)到zui合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應(yīng)的zui高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發(fā)生陽性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標(biāo)抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
結(jié)合物的保存
酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液臨用時按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作液。現(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長。
結(jié)合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測定，也可應(yīng)用這種稀釋液。
4.3 酶的底物
4.3.1 HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-
(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，zui適吸收波長為450nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，
經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍。
HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用zui多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。
AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一定時間。
AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。
洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。
酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的zui終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
4.6 陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控
制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相*。以人血清為標(biāo)本的測定，對照品zui也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血清較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，zui抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量zui在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
參考標(biāo)準(zhǔn)品
定量測定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-6個濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。
人抗肝可溶性抗原抗體(SLA)Elisa試劑盒樣本前處理簡介
一）樣本前處理的目的、內(nèi)容、重要性
1、目的
樣本處理的zui終目的是將待測組分從樣本中分離出來，并達(dá)到能夠檢測的狀態(tài)。
2、內(nèi)容
提取、凈化是主要的兩個內(nèi)容，也有的需要進(jìn)行濃縮甚至衍生化。
3、重要性
據(jù)統(tǒng)計，人們常常將60%的時間花在樣品前處理上。這不但不符合高效率的要求，而且煩瑣的傳統(tǒng)樣品處理方法也直接影響到zui后的分析結(jié)果。
二）殘留分析的樣品種類
組織（肌肉、肝臟、魚、蝦等）、蜂蜜、蜂王漿、花粉、飼料及其原料、腸衣、熟食、尿樣（豬尿、牛尿、羊尿等）、血清（牛血清、豬血清、雞血清等）、牛奶及奶粉、雞蛋、糞便等。
三）樣本前處理操作一般步驟
1、各種溶液配制
在實驗開始前按照說明書的要求配制出各種實驗需要的溶液，實驗室已有的的溶液也應(yīng)考慮溶液的配制日期以及有效期
2、樣本稱量/量取前的處理
有的樣本是冷凍保存，有的樣本在較低溫度時粘度較大在樣本且變得不均一，它們稱量/量取前必須解凍或加熱，夏天采用放置室內(nèi)解凍即可，冬天可以是防水的溫水浴解凍，或24/37度溫箱解凍，也可以采用暖氣片解凍，但是無論是什么樣的方式在解凍完成以后必須立即轉(zhuǎn)到室溫環(huán)境中來，以免變質(zhì)，值得一提的是某些藥物的實驗樣本的解凍方式必須使用室溫解凍，其他的解凍方式均對結(jié)果都有很大的影響
3、樣本稱量/量取
按照說明書規(guī)定的量進(jìn)行稱量/量取，對于外來復(fù)核的樣本稱量/量取應(yīng)更加的精確，當(dāng)稱量的量很少的情況下可由一般的天平轉(zhuǎn)到分析天平去稱量，天平也要按時進(jìn)行校正部分樣本采用量取的方式取樣，在量取前必須保證量取容器的準(zhǔn)確行；以保證樣本量準(zhǔn)確
4、樣本提取液加入
按照說明書給定的量和試劑/溶液的種類加入到樣本中，量少的情況下可以用移液器進(jìn)行轉(zhuǎn)移，當(dāng)需要的試劑/溶液量較大的情況下必須用移液管。
注:需要做添加高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的樣本,在加入提取液之前加入高濃度標(biāo)準(zhǔn)品
5、震/振搖
該步驟有兩種方式，一種為長時間的使用震蕩器上震蕩，該方法可定時定量，但對于某些實驗不適用，另一種為較強(qiáng)烈的振蕩，可用渦動儀強(qiáng)烈渦動，也可以人為的上下振蕩。不同的實驗對時間的要求也不同，要按照說明書進(jìn)行
6、離心
離心有三個影響因素，即為離心力、時間、溫度，需要設(shè)定的參數(shù)就是三個參數(shù)，具體的設(shè)定方式因離心機(jī)不同而有一定的差異，沒有條件的情況下要保證時間和離心機(jī)轉(zhuǎn)度。
7、取液
１）取上層：這是zui為常見和zui簡單的取液方式，僅僅需要按量取就可以
２）取中間層：zui不常見的取液方式，一般情況下是去掉全部上層再吸取中間層，對于一些經(jīng)驗較為豐富的實驗員在處理部分實驗時可以直接突破上層取中間層
３）取下層：較4是像取中間那樣進(jìn)行，值得注意的是，所有取液方式都有可能遇到取液時液體的量越取越體積越大，甚至吸到移液器內(nèi)，對于這樣的情況在取液時注意看液體的體積達(dá)到量就不繼續(xù)吸就可以了
7、吹干
吹干的三個影響因素為氣體、溫度、加熱方式
氣體：較為理想的吹干氣體為氮氣，出于成本問題多數(shù)小規(guī)模實驗室一般采用空氣吹干，
溫度：根據(jù)藥物與提取溶劑的物理性質(zhì)選擇一個合適的溫度，一般在50到60℃之間
加熱方式：一般有兩種方式，分為水浴方式和干浴
8、復(fù)溶
吹干以后加入復(fù)溶液將藥物溶解出來的過程，加速溶解的方式可為渦動溶解和超聲溶解，時間時情況而定，一般僅使用渦動溶解
9、樣本檢測
該步驟的具體操作見試劑盒說明書中的檢測步驟。
四）前處理相關(guān)試驗術(shù)語及定義
1、陰性和陽性
陰性：即樣本中不含被檢測物質(zhì)。
陽性：樣本中含有被檢測物質(zhì)。
2、假陰性與假陽性
假陰性：因某些因素的影響導(dǎo)致陽性樣本檢測結(jié)果為陰性的現(xiàn)象。
假陽性：因某些因素的影響導(dǎo)致陰性樣本檢測結(jié)果為陽性的現(xiàn)象。
3、靈敏度：試劑盒方法能檢測到待測藥物的zui底濃度。
4、準(zhǔn)確度：指測定值(平均值)與真值的接近程度，表示分析結(jié)果的真實性。通常用添加回收率來表示：
回收率=(測定值-空白值)/添加量 ×100％
5、精密度：指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品測定值彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性，常用變異系數(shù)表示。
6、檢測限（LOD limit of detection）：檢測限指分析方法能夠從樣本的背景信號中檢測出待測物存在時所需的zui低濃度。LOD反映了分析方法整體的靈敏度效能指標(biāo)。一般對分析方法在LOD水平的定量可信性（如精密度、回收率）不作要求，一般要求殘留分析方法LOD≦0.1MRL LOD=B+2SD或B+3SD
7、定量限（LOQ limit of quantitation）：指分析方法能夠?qū)悠分械拇郎y物進(jìn)行定量測定的zui低濃度，用于定量方法的驗證。
8、殘留檢測限（ＭＲＬ）
規(guī)定允許食品中藥物zui高殘留量，很多情況下各國規(guī)定的ＭＲＬ值之間有一定的差異，多數(shù)情況下我國規(guī)定的ＭＲＬ值較日本、歐盟、美國的高一些。
人抗肝可溶性抗原抗體(SLA)Elisa試劑盒基本配套儀器
1、微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
2、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置
3、均質(zhì)器
4、振蕩器
5、渦旋儀
6、離心機(jī)
7、天平：感量0.01g
8、微量移液器：單道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
9、超聲儀
10、恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱
11、冰箱
12、洗板機(jī)（可選）
13、磁力攪拌器
【儲存及有效期】 于2～8℃避光保存，有效期為12個月
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