EB病毒核酸檢測試劑盒PCR熒光探針法

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【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：EB病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
【包裝規(guī)格】
24 人份/盒
【預(yù)期用途】本產(chǎn)品用于人體血清或血漿樣本中EB病毒核酸的定量檢測。
EB 病 毒（ epstein-barr virus,EBv ）， 又名 人皰 疹病 毒 4 型 。 EB 病 毒的感 染非常普 遍，主要通 過唾液感 染，我國 95%以上人 群在 3~5 歲 就已感 染了 EB 病毒 。在 一般 情況下 ，EB 病毒引 起的感染 是無癥狀的， 尤其 是兒 童時(shí)期 。 急 性的 EB 病毒 感染 ， 會引 起傳 染性單 核細(xì)胞 增多 癥， 伴有 急性呼吸道感 染、 發(fā)熱、 淋 巴結(jié)腫大、 肝 、 脾腫大等病 癥， 在兒童中 高發(fā)。當(dāng)機(jī)體免 疫缺陷或免疫 系統(tǒng)處于抑制 狀態(tài)時(shí)，極易受
EB 病 毒 感染 ， 如 免疫 缺 陷 患 者、 T 細(xì) 胞 缺陷 患 者 、 移植后接受免 疫抑制治療常致嚴(yán)重的淋 巴 組 織 增生 性 疾 病 。 此 外 ， EB 病 毒 與 越 來越 多的人 類惡性腫瘤 有關(guān)，例如鼻 咽癌、霍奇金 淋巴瘤、非霍奇 金淋巴 瘤等。
實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具 備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。
EB病毒核酸檢測試劑盒PCR熒光探針法【檢驗(yàn)原理】
本產(chǎn)品選取 EB 病毒基因組 BamH1W 基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在 樣本 DNA 核酸純化之后采用熒光 PCR 對病毒 DNA 進(jìn)行檢測。
本產(chǎn)品采用煮沸裂解法提取病毒 DNA 模板，然后在 Taq 酶的作用下對
靶區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用 Taqman 熒光探針技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。 Taqman       探針帶有一個(gè)熒光發(fā)光基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，完整的探針在特定 光源激發(fā)下，發(fā)光基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光被淬滅基團(tuán)全部吸收，樣品無熒光。PCR 過程中，Taq 酶在延伸 DNA 鏈的同時(shí)，可通過自身的 5’→3’核酸外切酶活性 降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針，使熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，分離 后的熒光報(bào)告基團(tuán)在特定光源激發(fā)下產(chǎn)生熒光。通過監(jiān)測整個(gè) PCR 過程熒光 信號的變化，對未知模板進(jìn)行定性分析。
同時(shí)本產(chǎn)品采用內(nèi)標(biāo)質(zhì)控體系，用于監(jiān)測反應(yīng)體系可能存在的抑制因 素。內(nèi)標(biāo)模板與靶基因無同源性，內(nèi)標(biāo)探針選擇的是與靶基因探針沒有沖突 的另一檢測通道。注：1）不同批號試劑盒中各組分不可以互換。
2）試劑盒以 外必需的設(shè)備 及材料： 試劑盒以外必需的設(shè)備及材料： 熒光定量 PCR 儀、旋渦混合器、生物安全柜、迷你離心機(jī)、干式恒 溫儀或 水 浴 鍋、 移液器及 無 菌吸 頭、離心機(jī)及 無 菌離 心 管、PCR 反應(yīng)管、無粉乳膠手套。
儲存條件及有效期】
-20±5℃避光保存，有效期 6 個(gè)月。
開封后凍融不超過三次，穩(wěn)定保存不超過 2 個(gè)月。采用或干冰密封或 泡沫箱加冰密封運(yùn)輸，運(yùn)輸箱規(guī)格為 465×305×370cm，內(nèi)置 7 個(gè)冰袋（750g）
+9kg 干冰。
生產(chǎn)日期及失效日期見標(biāo)簽。
【適用儀器】
適用于 ABI 7500、Stratagene Mx3000P 熒光定量 PCR 儀。
【樣本要求】
1. 適用樣本類型：血清或血漿
2. 樣本采集:
2.1 血清 用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血 2ml，待 樣本自行析出血清后直接室溫 1600rpm 離心 5 分鐘分離出血清后轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌離心管中備用。
2.2 血漿 用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血 2ml，注 入含有 EDTA 的無菌收集管中，立即輕輕顛倒混勻，待樣本自行析出血漿后， 室溫 1600rpm 離心 5 分鐘分離出血漿后轉(zhuǎn)移至 1.5ml 滅菌離心管中備用。 3.樣本保存：
樣本收集后立即用冰塊保存或置于 4℃。樣本在 4℃保存不超過 72 小時(shí)，
-20℃條件下可以保存數(shù)月，長期保存請將樣本置于-70℃。 4 運(yùn)輸：
運(yùn) 輸 過 程 中 應(yīng) 采 用 不 易 碎 的 容 器 裝 載 樣 本 ， 并 且 視 作 潛 在 的 傳 染 源，避免外 漏。采用冰或干冰密封 或泡沫箱加 冰密封運(yùn)輸 ，避免樣 本運(yùn)輸途 中解凍， 影響 檢測結(jié)果。
【檢驗(yàn)方法】
1.樣本處理
1.1 樣本處理：
1）取 100µl 待檢樣本，加入 50µl 濃縮液，用漩渦振蕩器振蕩 15 秒混勻；
2）13,000rpm 離心 10 分鐘，小心吸出 150µl 上清液（盡量吸干上清液，但 不要觸及沉淀）并棄去，保存沉淀；
3）向離心管中加入 50µl 裂解液，然后用槍頭對準(zhǔn)沉淀所在位置，將其挑離 管底，并反復(fù)吹打，用漩渦振蕩器振蕩將沉淀充分打散；
4）100℃溫浴 10 分鐘，13,000rpm 離心 10 分鐘后靜置待用。
1.2      定量標(biāo)準(zhǔn)品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、陰性質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)模板無需抽提，使用 前室溫融化混勻。
2.試劑配制
2.1 檢測反應(yīng)設(shè)置陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，每孔均設(shè)有內(nèi)標(biāo)以反映體系對 PCR
反應(yīng)可能存在的抑制性。
2.2 配制過程
1) 提前 30 分鐘將試劑取出，室溫融化，短暫震蕩，離心數(shù)秒。
2) 確定反應(yīng)數(shù) N，N=待檢樣本數(shù)（n）+質(zhì)控品數(shù)（5）+1。計(jì)算加到反應(yīng) 混合物中的各個(gè)試劑的量，計(jì)算如下3) 取 1.5ml 無菌離心管配置反應(yīng)體系，試劑全部加入后震蕩混勻，離心數(shù)
秒。
4) 然后將上述混合液 23µl/管分裝至 PCR 反應(yīng)管中。
3.加樣
取陰性質(zhì)控品、定量標(biāo)準(zhǔn)品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、臨床樣本 DNA 各 2µl
分別加入 PCR 反應(yīng)管中，蓋緊管蓋（避免氣泡產(chǎn)生）短暫離心將管壁上的液 體全部甩至管底，然后立即進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。
4.PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置
4.1ABI7500 Real-Time PCR System<Version 1.4 >
1) 打開軟件，默認(rèn)首頁面的各選項(xiàng)后點(diǎn)擊 Next，進(jìn)入 Select Detectors 對話 框選擇本次實(shí)驗(yàn)所需的探針類型（如果供選欄內(nèi)沒有可以新建）：靶基因探針 報(bào)告基團(tuán)（Reporter）為 FAM，淬滅基團(tuán)（Quencher）為 None；內(nèi)標(biāo)探針報(bào) 告基團(tuán)為 HEX，淬滅基團(tuán)為 None。在左邊一欄中選定探針類型后，點(diǎn)擊 Add 將 所 選 擇 的 探 針 加 入 到 右 欄 (Detectors in Document) 中 ， 右 上 角 passive reference 選擇 None。參數(shù)設(shè)置確認(rèn)無誤后選擇 Next，進(jìn)入 Setup Sample Plate 界面，然后點(diǎn)擊 Finish。
2) 進(jìn)入 Setup 頁面后，按照本次實(shí)驗(yàn)樣本在樣品盤上的實(shí)際位置，選取相 應(yīng)孔位，并勾選對應(yīng)的靶基因和內(nèi)標(biāo)模板探針類型。陰性質(zhì)控品在“Task”一 欄選擇“NTC”；定量標(biāo)準(zhǔn)品（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）樣本“Task”一欄選擇“Standard”， 樣本“Task”一欄選擇“Unknown”。如果需要編輯樣品名，可直接點(diǎn)擊相應(yīng)孔 位后錄入，確認(rèn)后選擇 Finish。
3) 進(jìn)入 Instrument 頁面，在此頁面中的熱循環(huán)參數(shù)控制面板（Thermal Cycle Protocol）內(nèi)，設(shè)置所需的擴(kuò)增程序（見下表），并根據(jù)實(shí)際情況輸入擴(kuò)增體 積（Sample Volume）、選擇運(yùn)行模式（Run Mode: Standard 7500），以及設(shè)定 收集熒光的步驟（Data Collection，黃色區(qū)域顯示）。確認(rèn)無誤后，將結(jié)果保 存，點(diǎn)擊 Start 開始擴(kuò)增檢測。
4.2Stratagene Mx3000P 型熒光定量 PCR 儀
1) 面板設(shè)置：雙擊“MxPro”圖標(biāo)打開軟件，選擇 Quantitative PCR（Multiple Standards），點(diǎn)擊“OK” ；選中試劑所放的孔位，確認(rèn)與儀器相對應(yīng)，隨后在 “Well       type”的下拉選框里選擇相應(yīng)的樣本類型：待測樣本選擇“Unknown”、 陰性質(zhì)控品選擇“NTC”、定量標(biāo)準(zhǔn)品選擇“Standard”，在“Collect      fluorescence dat”內(nèi)的“FAM”和“HEX”通道前劃“√”；依次選中每一個(gè)“Standard”（標(biāo)準(zhǔn)品） 孔，在“Standard      quantity”右側(cè)的選項(xiàng)框內(nèi)依次選擇需要定量的通道“FAM”及 輸入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
2) 反應(yīng)條件設(shè)置：單擊進(jìn)入“Thermal Profile Setup”頁面，在此頁面設(shè)置所 需的擴(kuò)增程序（見下表），確認(rèn)無誤后，將結(jié)果保存，點(diǎn)擊“RUN”開始擴(kuò)增檢 測：
5. 結(jié)果分析條件的設(shè)定
5.1ABI 7500 Real-Time PCR System<Version 1.4 >
反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù) PCR 儀說明書及熒光曲線進(jìn)行手動(dòng)或自動(dòng)調(diào)整基線和閾 值?；€（baseline）的起始點(diǎn)（Start）一般設(shè)定在 5～8 之間，終止點(diǎn)（Stop）一般設(shè)定在 12～15 之間，閾值線（threshold）通常設(shè)定在 1000～5000 之間
（視具體情況而定）。將定量標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的濃度輸入儀器軟件中，設(shè)定之后， 點(diǎn)擊分析（Analyse）按鍵，可以從 Reports 窗口得到各樣本的 Ct 值和相應(yīng)的 初始濃度。
5.2Stratagene Mx3000P 型熒光定量 PCR 儀 反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光曲線進(jìn)行手動(dòng)或自動(dòng)調(diào)整基線和閾值，手動(dòng)調(diào)整基線 (Non-adaptive baseline)的起始點(diǎn)（Start）一般設(shè)定為 5～8，終止點(diǎn)（Stop）
一般設(shè)定為 12～15，閾值線（threshold fluorescence）通常設(shè)定在 500-2000 之間（視具體情況而定）。依次選中每一個(gè)“Standard”（標(biāo)準(zhǔn)品）孔，在“Standard quantity”右側(cè)的選項(xiàng)框內(nèi)依次選擇需要定量的通道“FAM”及輸入相應(yīng)的定量 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。設(shè)定之后，可以從“Text report”窗口得到各樣本的 Ct 值和相 應(yīng)的初始濃度。
6. 質(zhì)量控制
6.1 內(nèi)標(biāo)：用于監(jiān)測 PCR 反應(yīng)中可能出現(xiàn)的抑制情況。HEX 通道應(yīng)出現(xiàn) S
型曲線，Ct 值≤35。
6.2  陰性質(zhì)控品： FAM 通道無 S 型曲線， 在 Reports 界面 Ct 一欄顯示
Undetermined；HEX 通道有 S 型曲線，且 Ct 值≤35.0。
6.3 定量標(biāo)準(zhǔn)品Ⅰ-Ⅳ：用作陽性質(zhì)控及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。FAM 通道有 S 型曲 線，且 Ct 值≤35。HEX 通道有 S 型曲線，且 Ct 值≤35.0。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) |R| (|r|)  ≥ 0.99，或 R2 (r2)  ≥ 0.98。 以上條件必須在同一次實(shí)驗(yàn)中全部滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。
【參考值范圍】
待檢樣本測定值顯示＜1×103 copies/ml，則報(bào)告為“低于試劑盒zui低檢出 限(1×103 copies/ml）”，測定值在 1×103 copies/ml～5×103 copies/ml 之間的樣 本，直接報(bào)告所測定的數(shù)值，并注明“供參考”，測定值在 5×103 copies/ml～
5×108 copies/ml 之間的樣本，直接報(bào)告所測定的數(shù)值。參考值范圍由大量不 同濃度的線性參考品的檢測結(jié)果確定。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
1. 如果 HEX 通道沒有出現(xiàn) S 型曲線，檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測。高濃度 樣本（Ct 值≤25），由于競爭抑制， HEX 通道無 S 型曲線屬于正常情況。
2. 如果 HEX 通道出現(xiàn) S 型曲線，同時(shí) FAM 通道檢測無 S 型曲線，則檢測
報(bào)告為“低于試劑盒zui低檢出限（1×103        copies/ml）”。
3. 如果 HEX 通道出現(xiàn) S 型曲線，同時(shí) FAM 通道檢測有 S 型曲線，則有如 下解釋：
3.1 如果待檢樣本測定值顯示＜1×103 copies/ml，則報(bào)告為“低于試劑盒zui低 檢出限(1×103 copies/ml）”。
3.2 測定值在 1×103 copies/ml～5×103 copies/ml 之間的樣本，直接報(bào)告所測
定的數(shù)值，并注明“供參考”。
3.3 測定值在 5×103 copies/ml～5×108 copies/ml 之間的樣本，直接報(bào)告所測 定的數(shù)值；
3.4 測定值大于 5×108copies/ml 的樣本，建議將樣本稀釋至線性范圍后重新 測定，并根據(jù)下面公式計(jì)算樣本濃度，結(jié)果注明為可報(bào)告數(shù)值。 可報(bào)告數(shù)值(zui終樣本濃度)=稀釋后濃度×稀釋倍數(shù)
稀釋倍數(shù)=(樣本量+稀釋液量)/樣本量
4 zui適樣本類型、感染類型及感染后的zui高病毒滴度時(shí)間未經(jīng)驗(yàn)證，因此， 在同一患者分次、多部位采集樣本可能會避免假陰性。
5 不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，樣本中的病毒滴度過低均有可能導(dǎo)致假 陰性結(jié)果。
6 病毒檢測靶序列的變異會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
7      本檢測結(jié)果僅供臨床參考，如需確診請結(jié)合臨床癥狀和其他檢測手段。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1.    當(dāng)樣本中被檢測核酸濃度低于zui低檢測限 1×103 copies/ml 時(shí)，可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

2. 擴(kuò)增產(chǎn)物的污染和核酸提取中標(biāo)本間的交叉污染，很容易出現(xiàn)假陽性結(jié) 果。因此，PCR 臨床應(yīng)用必須要有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)室管理和 質(zhì)量控制措施。
3.    樣本中殘留的蛋白質(zhì)成分對 PCR 擴(kuò)增有抑制作用，在樣本處理的取上 清時(shí)應(yīng)避免吸入白色沉淀物質(zhì)。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
1 分析靈敏度：根據(jù)產(chǎn)品分析性能評估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為 1×103 copies/ml。
2 分析特異性：
a.對于可能存在檢測干擾的病原體：人巨細(xì)胞病毒、BK 病毒、JC 病毒、梅 毒、甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒Ⅰ型、單 純皰疹病毒Ⅱ型、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、皰疹病毒 6 型、皰疹病毒 7 型、
結(jié)核桿菌、人乳頭瘤病毒 HPV(6, 11, 16, 18)、沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲
原體、肺炎支原體（MP）、肺炎衣原體（CP）、腸道病毒 71 型（EV71）、柯 薩奇 a16 型(CA16)等病原體陽性樣本，本試劑盒檢測結(jié)果均為陰性。
b. 干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)高濃度的膽紅素（279.8μmol/L）、甘油三
酯（62.33 mmol/L）、血紅蛋白（167g/L）對 PCR 結(jié)果無明顯干擾。
3 精密度：同一批試劑對樣本進(jìn)行 10 次重復(fù)檢測，檢測濃度對數(shù)值的變異 系數(shù) CV≤5%（n=10）。
4 線性檢測范圍：5×103 copies/ml~5×108 copies/ml。 5 臨床試驗(yàn)：
臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本試劑盒的靈敏度為 99.52%，特異性為 98.08%。
【注意事項(xiàng)】
1. 實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本說明書。
2. 本品僅用 于體外診斷。
3. 使用本產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)遵循臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)規(guī)范進(jìn)行操作。
4. 請自備移液器，振蕩器，離心機(jī)，無菌且?guī)V芯吸頭、離心管、PCR 反應(yīng)管，及無粉一次性乳膠手套。
5. 樣本處理在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作，防止污染環(huán)境和保護(hù)操作者。
6. 樣本操作和處理需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》。
7. 實(shí)驗(yàn)后的廢棄物品，如吸頭、擴(kuò)增產(chǎn)物等需進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。
8.試劑盒中的陽性質(zhì)控品是體外純化的質(zhì)粒，無傳染性，但操作時(shí)應(yīng)仍視為 傳染性物質(zhì)進(jìn)行處理。 
9.樣本核酸提取完畢后，建議立即進(jìn)行檢測，否則請保存于-20℃，并且在24 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測。
10. 實(shí)驗(yàn)完畢后使用 10%次氯酸或 75%乙醇處理操作臺面和移液器、離心 機(jī)、PCR 儀表面，然后紫外燈照射 25-30 分鐘。
11. 不同批號試劑盒中各組份不可以互換，請?jiān)谟行趦?nèi)使用本試劑盒，不
使用本試劑盒中的組分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可能會導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。
【參考文獻(xiàn)】
1Ruiz G, Peña P, de Ory F et al. Comparison of commercial real-time PCR assays for quantification of Epstein-Barr virus DNA.J Clin Microbiol,2005 May;43(5):2053-7
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