禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品名稱；禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：50次

產(chǎn)品用途：檢測H5亞型禽流感病毒

檢測樣本：咽肛拭子，喉氣管、胸肌、心肌和肺等組織，血清

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產(chǎn)品部分說明如下，由于篇幅限制，如需更加詳細(xì)說明書請聯(lián)系--。

禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒需要自備的物品

1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。

2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、1.5 mL滅菌離心管、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）、滅菌雙蒸水。

注意事項

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。

2．PCR整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm離心15 s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20 ℃。

4．消化液低溫時可能出現(xiàn)結(jié)晶，請于37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。

5． 染色液低毒，操作時應(yīng)戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于4℃，以免揮發(fā)變干。染色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。

6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

7．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在3次內(nèi)用完，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺的動物，取肺、淋巴結(jié)等組織；待檢活動物，用注射器取血5 mL。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料。）

2 樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取上清液100 μL于1.5 mL滅菌離心管中，再加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振蕩混勻后，置56 ℃水浴中消化1小時。

2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清100 μL，加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振蕩混勻后，置56 ℃水浴中消化1小時。

2.3 陽性對照處理：取陽性對照100 μL，加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振蕩混勻后，置56 ℃水浴中消化1小時。

2.4 陰性對照處理：取陰性對照100 μL，加入200 μL消化液和20 μL蛋白酶K，振蕩混勻后，置56 ℃水浴中消化1小時。

操作步驟

1 病毒DNA的提取

1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入300 μL DNA結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），室溫靜置3 min，10000 rpm離心30 s。

1.2 棄去收集管中液體，加入500 μL DNA洗滌液，10000 rpm離心30 s。

1.3 重復(fù)步驟1.2。

1.4 棄去收集管中液體，10000 rpm空柱離心1 min，以除去殘留的DNA洗滌液。

1.5將吸附柱放入新的1.5 mL離心管中，向柱中央加入DNA洗脫液（56 ℃預(yù)熱）50 μL，室溫放置2 min，10000 rpm離心30 s，離心管中液體即為模板DNA。

2 PCR擴(kuò)增

每份總體積20 μL，含16 μL PCR反應(yīng)液（用前混勻），2 μL Taq DNA聚合酶，2 μL模板DNA。

例如：n份樣品，配制n+1份，16×（n+1）PCR反應(yīng)液，再加入2×（n+1）Taq DNA聚合酶，混勻后取18 μL分裝成n份，分別加入2 μL模板DNA，加入20 μL礦物油覆蓋（有熱蓋的PCR擴(kuò)增儀不用加），作好標(biāo)記。

在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：94 ℃ 3 min；循環(huán)94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35次；再72 ℃延伸10 min。

3電泳

稱2 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液200 mL（取4 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至200 mL），于微波爐中熔解，再加入10 μL 染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL混合2 μL上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120 V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

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