禽流感病毒通用型與H5亞型雙重實(shí)時(shí)熒光

禽流感病毒通用型與H5亞型雙重實(shí)時(shí)熒光利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)

禽流感病毒通用型與H5亞型雙重實(shí)時(shí)熒光用途 本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物及尿囊液中禽流感病毒
（AIV）和 H5 亞型（AIV-H5）的 RNA，適用于 AIV、AIV-H5 的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取樣品總 RNA，在高效反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引
物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在熱啟動(dòng) Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及
延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利用
Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利用熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。
試劑盒組成

 

保存期 本產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月。
需要自備的器材
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20
µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。
使用注意事項(xiàng)
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。
2．PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán)
禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s，
使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立
即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過(guò)程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時(shí)間。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過(guò)有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴(yán)格遵守操作說(shuō)明可以獲得最的結(jié)果。操作過(guò)程中移液、定時(shí)等全部過(guò)程必須精確。
7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格控制污染。
8．反復(fù)凍融試劑將降低檢測(cè)靈敏度，本試劑盒應(yīng)在 3 次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸
道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，
嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.02 g
于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm
離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 陽(yáng)性對(duì)照處理：取陽(yáng)性對(duì)照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
禽流感病毒通用型與H5亞型雙重實(shí)時(shí)熒光操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～
5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)
堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復(fù)步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm
離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 操作
 設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為 N，每份總體積 20µL，反應(yīng)體系配制如下：
試劑 體系
無(wú)菌無(wú)核酸酶水 2.3（N+1）µL
RT-PCR 反應(yīng)液 10（N+1）µL
酶混合液 0.4（N+1）µL
熒光探針 2.3（N+1）µL
 將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 15 µL。
分別取 5 µL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，其中 AIV 熒光報(bào)告基團(tuán)為 FAM，
AIV-H5 為 HEX，淬滅基團(tuán)均為 None（如果儀器沒(méi)有 HEX 校正過(guò)，可暫時(shí)用 VIC 代替）。在熒光
PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個(gè)循環(huán)第二步（60℃
35s）收集熒光信號(hào)，共 40 個(gè)循環(huán)。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定
閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音
情況進(jìn)行調(diào)整。
2 結(jié)果描述及判定
陽(yáng)性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú) Ct 值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成
立；被檢樣品若 FAM 熒光信號(hào) Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 AIV 陽(yáng)性；被檢樣品若 Hex 熒光
信號(hào) Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 H5 陽(yáng)性；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，需
重新取樣提取 RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽(yáng)性；被檢樣品 Ct 值≥35 時(shí)，
超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣品，應(yīng)為陰
性。