雞傳染性喉氣管炎病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒

雞傳染性喉氣管炎病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)

雞傳染性喉氣管炎病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒用途 本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法檢測(cè)雞氣管腔分泌物中的 ILTV，適用于 ILTV 的檢測(cè)、診
斷和流行病學(xué)調(diào)查。
原理 利用離心柱內(nèi)惰性大分子膜提取病料 DNA 作為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 DNA 模板，在熱
啟動(dòng) Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，
經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報(bào)告基
團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利用熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品 Ct 值
的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

試劑盒的組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月。
需要自備的物品
1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2
µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 滅菌離心管、吸頭（10 µL、
200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。
雞傳染性喉氣管炎病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。
2．PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán)
禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s，
使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立
即放回-20 ℃。
4．消化液低溫時(shí)可能出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)于 37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。
7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格控制污染。
8．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。
9．反復(fù)凍融試劑將減低檢測(cè)靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：待檢活雞或死雞，用棉拭子取氣管腔分泌物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，
送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 拭子樣品處理：震蕩混勻，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和
20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃水浴中消化 1 小時(shí)。
2.2 陽(yáng)性對(duì)照處理：取陽(yáng)性對(duì)照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時(shí)。
2.3 陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時(shí)。
操作步驟
1 病毒 DNA 的提取
1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入 300 μL DNA 結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸
附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵塞吸附柱），室溫
靜置 3 min，10000 rpm 離心 30 s。
1.2 棄去收集管中液體，加入 500 μL DNA 洗滌液，10000 rpm 離心 30 s。
1.3 重復(fù)步驟 1.2。
1.4 棄去收集管中液體，10000 rpm 空柱離心 1 min，以除去殘留的 DNA 洗滌液。
1.5 將吸附柱放入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入 DNA 洗脫液（ 56 ℃預(yù)熱）50 μL，室溫
放置 2 min，10000 rpm 離心 30 s，離心管中液體即為模板 DNA。
2 實(shí)時(shí)熒光 PCR 操作
 設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為 N，則反應(yīng)體系配制如下：
試劑 體系
無(wú)菌無(wú)核酸酶水 5.9×（N+1）µL
PCR 反應(yīng)液 10×（N+1）µL
熒光探針 2.1×（N+1）µL
 將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 18 µL。
分別取 2 µL 模板 DNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記。在熒光 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下
反應(yīng)：95 ℃ 2 min；循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 次，每次循環(huán)的第二步（60 ℃ 35 s）收集熒光
信號(hào)（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”）。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定
閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音
情況進(jìn)行調(diào)整。
2 結(jié)果描述及判定
 陽(yáng)性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú) Ct 值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成
立；被檢樣品 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 ILTV 陽(yáng)性；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)
增曲線，需重新取樣提取 DNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判定為陽(yáng)性；被檢樣品 Ct
值≥35 時(shí)，超過本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣
品，應(yīng)為陰性