豬瘟兔化弱毒疫苗實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒

豬瘟兔化弱毒疫苗實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)

豬瘟兔化弱毒疫苗實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒用途 豬瘟病毒（CSFV）通用型反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)疑似感染
動(dòng)物的血清或組織中的 CSFV，適用于 CSFV 的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。該試劑盒不能用于區(qū)分
強(qiáng)弱毒。
原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合
成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的
循環(huán)，使特異 DNA段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán)，最終使擴(kuò)增 DNA段放大了數(shù)百萬倍。
將擴(kuò)增 DNA段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA段的擴(kuò)增帶。

試劑盒的組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 6 個(gè)月。
需自備的物品
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微
波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL 量筒、500 mL
錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌 1.5mL 離心管和吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、
滅菌雙蒸水。
豬瘟兔化弱毒疫苗實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。
2．PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增
區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s，使
液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放
回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時(shí)間。
5． 染色液低毒，操作時(shí)應(yīng)戴上手套，避光保存，較長(zhǎng)時(shí)間不使用請(qǐng)存放于 4℃，以免揮發(fā)變干。染色液和上樣緩沖液使用前也請(qǐng)離心使液體沉于管底。
6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
7．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。
8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測(cè)靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺的豬，取扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織；待檢活豬，用
注射器取血 5 mL。2～8 ℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g 于
研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心
2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對(duì)照處理：取陽性對(duì)照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～5
min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵
塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復(fù)步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm 離
心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 RT-PCR 擴(kuò)增
每份總體積 20 µL，含 16.8 µL RT-PCR 反應(yīng)液（用前混勻），1.2 µL 酶混合液，2 µL 模板 RNA。
例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反應(yīng)液，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，
混勻后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 RNA，加入礦物油 20 µL 覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴(kuò)增
儀不用加礦物油），作好標(biāo)記。
在 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；循環(huán) 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25
s，共 35 次；再 72 ℃延伸 10 min。
3 電泳
稱 4 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍AE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10 µL 混合 2 µL 上樣緩沖液，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以 110～120V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。
結(jié)果判定 陽性對(duì)照出現(xiàn) 235 bp 擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。
被檢樣品出現(xiàn) 235 bp 擴(kuò)增帶為豬瘟病毒陽性，否則為陰性。