豬偽狂犬病毒（gE基因）PCR檢測試劑盒

豬偽狂犬病毒（gE基因）PCR檢測試劑盒利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)

豬偽狂犬病毒（gE基因）PCR檢測試劑盒用途 豬偽狂犬病毒（gE 基因）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗用于檢測豬血清、組織和精液中的豬
偽狂犬病毒 gE 基因。適用于 PRV 野毒感染或感染過含有 gE 抗原的疫苗和 gE 基因缺失疫苗的鑒別
診斷、檢測和流行病學(xué)調(diào)查。
原理 利用離心柱內(nèi)惰性大分子膜提取病料 DNA 作為模板，高溫使模板的一條雙鏈 DNA 變性后形
成兩條單鏈，低溫使引物與互補的模板形成雙鏈，中溫時，在 TaqDNA 聚合酶作用下，以 dNTP 為原料，
以引物為復(fù)制的起點，沿模板合成一條新鏈。每個循環(huán)包括：高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個過程。
每一次循環(huán)使擴增的 DNA 片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán)，使擴增的 DNA 片段放大了數(shù)百萬倍。
將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA 片段的擴增帶。

試劑盒的組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 6 個月。
需要自備的物品
1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分
析儀）、微波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、1.5 mL 滅菌離心管、瓊脂糖、500 mL
量筒、500 mL 錐形瓶、吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。
豬偽狂犬病毒（gE基因）PCR檢測試劑盒注意事項
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴
增區(qū)→電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s，
使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立
即放回-20 ℃。
4．消化液低溫時可能出現(xiàn)結(jié)晶，請于 37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。
5． 染色液低毒，操作時應(yīng)戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于 4℃，以免揮發(fā)變干。
染色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。
6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
7．嚴格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺豬，取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織；待檢活
豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5 mL。2～8 ℃保存，送
實驗室檢測。
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g
于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm
離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，
振蕩混勻后，置 56 ℃水浴中消化 1 小時。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，
置 56 ℃水浴中消化 1 小時。
2.3 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時。
2.4 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時。
豬偽狂犬病毒（gE基因）PCR檢測試劑盒操作步驟
1 病毒 DNA 的提取
1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入 300 μL DNA 結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸
附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），室溫
靜置 3 min，10000 rpm 離心 30 s。
1.2 棄去收集管中液體，加入 500 μL DNA 洗滌液，10000 rpm 離心 30 s。
1.3 重復(fù)步驟 1.2。
1.4 棄去收集管中液體，10000 rpm 空柱離心 1 min，以除去殘留的 DNA 洗滌液。
1.5 將吸附柱放入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入 DNA 洗脫液（ 56 ℃預(yù)熱）50 μL，室溫放置 2 min，10000 rpm 離心 30 s，離心管中液體即為模板 DNA。
2 PCR 擴增每份總體積 20 µL，含 16 µL PCR 反應(yīng)液（用前混勻），2 µL Taq DNA 聚合酶，2 µL 模板 DNA。
例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16×（n+1）PCR 反應(yīng)液，再加入 2×（n+1）Taq DNA 聚合酶，
混勻后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 DNA，加入 20 µL 礦物油覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴增儀不用加），作好標(biāo)記。
在 PCR 擴增儀上進行以下程序：94 ℃ 3 min；循環(huán) 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 次；再 72 ℃延伸 7 min。
3 電泳
稱 3 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴增產(chǎn)物 10 µL 混合 2 µL 上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以 110～120 V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。
結(jié)果判定 陽性對照出現(xiàn) 345 bp 擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。
被檢樣品出現(xiàn) 345bp 擴增帶為 PRVgE 陽性，否則為陰性。