豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測試劑盒

豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測試劑盒用途 本試劑盒采用實時熒光 PCR 方法檢測豬血清、組織和精液中的豬偽狂犬病毒 gB 基因，適用于 PRV 野毒感染或感染過含有 gB 抗原的疫苗的鑒別診斷、檢測和流行病學調查。
原理 利用離心柱內惰性大分子膜提取病料 DNA 作為模板，以引物為起點合成與 DNA 模板，在熱
啟動 Taq 酶的作用下，經高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數放大一倍，
經熒光素標記的探針與擴增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報告基
團與淬滅基團分離，發(fā)出特異性熒光信號，利用熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據樣品 Ct 值
的大小及擴增曲線的形成情況判定結果。

試劑盒的組成

保存期 本產品有效期為 12 個月。
需要自備的物品
1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調移液器（2
µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 滅菌離心管、吸頭（10 µL、
200 µL、1000 µL）、滅菌雙蒸水。
豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測試劑盒注意事項
1．所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)。嚴
禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應*融化，8000 rpm 離心 15 s，
使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立
即放回-20 ℃。
4．消化液低溫時可能出現(xiàn)結晶，請于 37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴格遵守操作說明可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
7．反應體系應在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴格控制污染。
8．嚴格遵守操作說明可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
9．反復凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺豬，取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結等組織；待檢活
豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5 mL，或取精液置于 1.5 mL
離心管中。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻后取 0.05 g
于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm
離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，
振蕩混勻后，置 56 ℃水浴中消化 1 小時。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，
置 56 ℃水浴中消化 1 小時。
2.3 精液樣品處理：樣品不要離心，振蕩混勻后取 100 µL，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，
振蕩混勻后，置 56 ℃水浴中消化 3 小時，每隔 1 小時取出振蕩混勻 30s，再放回水浴繼續(xù)消化。
2.4 疫苗樣品處理：加入生理鹽水溶解成 1 頭份/100µL，振蕩混勻后取 100 µL，再加入 200 µL 消化
液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃水浴中消化 1 小時。
2.5 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時。
2.6 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時。
操作步驟
1 病毒 DNA 的提取
1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入 300 μL DNA 結合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸
附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質，以免離心時堵塞吸附柱），室溫
靜置 3 min，10000 rpm 離心 30 s。
1.2 棄去收集管中液體，加入 500 μL DNA 洗滌液，10000 rpm 離心 30 s。
1.3 重復步驟 1.2。
1.4 棄去收集管中液體，10000 rpm 空柱離心 1 min，以除去殘留的 DNA 洗滌液。
1.5 將吸附柱放入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入 DNA 洗脫液（ 56 ℃預熱）50 μL，室溫
放置 2 min，10000 rpm 離心 30 s，離心管中液體即為模板 DNA。
2 實時熒光 PCR 操作
 設被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N，則反應體系配制如下：
試劑 體系
無菌無核酸酶水 5.9×（N+1）µL
PCR 反應液 10×（N+1）µL
熒光探針 2.1×（N+1）µL
 將以上配制的反應體系充分混勻后，分裝每個反應管中各 18 µL。
分別取 2 µL 模板 DNA，加入相應反應管中，混勻并作好標記。在熒光 PCR 擴增儀上進行以下
反應：95 ℃ 2 min；循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 次，每次循環(huán)的第二步（60 ℃ 35 s）收集熒光
信號（報告基團“FAM”，淬滅基團“None”）。
結果判定
1 結果分析條件設定
閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據儀器噪音
情況進行調整。
2 結果描述及判定
 陽性對照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無 Ct 值并且無特定擴增曲線，實驗結果成立；被檢樣品 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴增曲線為 PRV 陽性；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提取 DNA，擴增后進行結果判定，如仍是可疑，則判定為陽性；被檢樣品 Ct值≥35 時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣品，應為陰性。