豬偽狂犬病毒與圓環(huán)病毒雙重PCR檢測試劑盒

豬偽狂犬病毒與圓環(huán)病毒雙重PCR檢測試劑盒用途 本試劑盒采用實時熒光 PCR 方法檢測豬血清和組織中的豬圓環(huán)病毒 2 型和豬偽狂犬病毒的 DNA，適用于 PCV-2 和 PRV 鑒別診斷、檢測和流行病學調(diào)查。
原理 利用離心柱內(nèi)惰性大分子膜提取病料 DNA 作為模板，以引物為起點合成與 DNA 模板，在熱啟動Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標記的探針與擴增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出特異性熒光信號，利用熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結(jié)果。

試劑盒的組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 12 個月。
需要自備的物品
1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機、熒光 PCR 擴增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、
20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、
1000 µL）、滅菌雙蒸水。
豬偽狂犬病毒與圓環(huán)病毒雙重PCR檢測試劑盒注意事項
1．所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)。嚴禁器材
和試劑倒流。
3．所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應*融化，8000 rpm 離心 15 s，使液體
全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20 ℃。
4．消化液低溫時可能出現(xiàn)結(jié)晶，請于 37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
7．反應體系應在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中配制，整個實驗過程嚴格控制污染。

8．嚴格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
9．反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺的豬，取肺、淋巴結(jié)、大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋等組織；待檢活豬，用注
射器取血 5 mL。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融病料。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g 于研磨
器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，
取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時。
2.3 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃水
浴中消化 1 小時。
2.4 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃水
浴中消化 1 小時。
操作步驟
1 病毒 DNA 的提取
1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入 300 μL DNA 結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸附柱
中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），室溫靜置 3 min，
10000 rpm 離心 30 s。
1.2 棄去收集管中液體，加入 500 μL DNA 洗滌液，10000 rpm 離心 30 s。
1.3 重復步驟 1.2。
1.4 棄去收集管中液體，10000 rpm 空柱離心 1 min，以除去殘留的 DNA 洗滌液。
1.5 將吸附柱放入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入 DNA 洗脫液（ 56 ℃預熱）50 μL，室溫放置 2
min，10000 rpm 離心 30 s，離心管中液體即為模板 DNA。
2 實時熒光 PCR 操作
 設被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N，則反應體系配制如下：
試劑 體系
無菌無核酸酶水 4×（N+1）µL
PCR 反應液 10×（N+1）µL
熒光探針 4×（N+1）µL
將以上配制的反應體系充分混勻后，分裝每個反應管中各 18 µL。
分別取 2 µL 模板 DNA，加入相應反應管中，混勻并作好標記，其中 PCV-2 熒光報告基團為 FAM，
PRV 為 HEX，淬滅基團均為 None（如果儀器沒有 HEX 校正過，可暫時用 VIC 代替）。在熒光 PCR 儀上
進行以下反應：95 ℃ 2 min；循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 次，每次循環(huán)的第二步（60 ℃ 35 s）分別
收集熒光信號。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設定
閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進
行調(diào)整。
2 結(jié)果描述及判定
 陽性對照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無 Ct 值并且無特定擴增曲線，實驗結(jié)果成立；
被檢樣品若 FAM 熒光信號 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴增曲線為 PCV-2 陽性；被檢樣品若 HEX 熒光信號 Ct
值≤30 并出現(xiàn)特定的擴增曲線為 PRV 陽性；被檢樣品 30＜Ct＜37 并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提
取 DNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥37 時，超過本方法檢測靈
敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣品，應為陰性。