豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒

豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒用途 本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法檢測(cè)豬血清和組織中的豬圓環(huán)病毒 2 型和豬偽狂犬病毒的 DNA，適用于 PCV-2 和 PRV 鑒別診斷、檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
原理 利用離心柱內(nèi)惰性大分子膜提取病料 DNA 作為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 DNA 模板，在熱啟動(dòng)Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利用熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

試劑盒的組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月。
需要自備的物品
1．儀器：分析天平、水浴鍋、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、
20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL 滅菌離心管、吸頭（10 µL、200 µL、
1000 µL）、滅菌雙蒸水。
豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。
2．PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán)禁器材
和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000 rpm 離心 15 s，使液體
全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20 ℃。
4．消化液低溫時(shí)可能出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)于 37 ℃溫育，溶解至澄清透明后使用。
5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
6．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。
7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格控制污染。

8．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。
9．反復(fù)凍融試劑將降低檢測(cè)靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺的豬，取肺、淋巴結(jié)、大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋等組織；待檢活豬，用注
射器取血 5 mL。2～8 ℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g 于研磨
器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，
取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中，再加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時(shí)。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃
水浴中消化 1 小時(shí)。
2.3 陽性對(duì)照處理：取陽性對(duì)照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃水
浴中消化 1 小時(shí)。
2.4 陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100 µL，加入 200 µL 消化液和 20 µL 蛋白酶 K，振蕩混勻后，置 56 ℃水
浴中消化 1 小時(shí)。
操作步驟
1 病毒 DNA 的提取
1.1 從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入 300 μL DNA 結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸附柱
中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵塞吸附柱），室溫靜置 3 min，
10000 rpm 離心 30 s。
1.2 棄去收集管中液體，加入 500 μL DNA 洗滌液，10000 rpm 離心 30 s。
1.3 重復(fù)步驟 1.2。
1.4 棄去收集管中液體，10000 rpm 空柱離心 1 min，以除去殘留的 DNA 洗滌液。
1.5 將吸附柱放入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入 DNA 洗脫液（ 56 ℃預(yù)熱）50 μL，室溫放置 2
min，10000 rpm 離心 30 s，離心管中液體即為模板 DNA。
2 實(shí)時(shí)熒光 PCR 操作
 設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照總和為 N，則反應(yīng)體系配制如下：
試劑 體系
無菌無核酸酶水 4×（N+1）µL
PCR 反應(yīng)液 10×（N+1）µL
熒光探針 4×（N+1）µL
將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 18 µL。
分別取 2 µL 模板 DNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，其中 PCV-2 熒光報(bào)告基團(tuán)為 FAM，
PRV 為 HEX，淬滅基團(tuán)均為 None（如果儀器沒有 HEX 校正過，可暫時(shí)用 VIC 代替）。在熒光 PCR 儀上
進(jìn)行以下反應(yīng)：95 ℃ 2 min；循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共 40 次，每次循環(huán)的第二步（60 ℃ 35 s）分別
收集熒光信號(hào)。
結(jié)果判定
1 結(jié)果分析條件設(shè)定
閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)
行調(diào)整。
2 結(jié)果描述及判定
 陽性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無 Ct 值并且無特定擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立；
被檢樣品若 FAM 熒光信號(hào) Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 PCV-2 陽性；被檢樣品若 HEX 熒光信號(hào) Ct
值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線為 PRV 陽性；被檢樣品 30＜Ct＜37 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，需重新取樣提
取 DNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥37 時(shí)，超過本方法檢測(cè)靈
敏度范圍，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線，但本底較高的樣品，應(yīng)為陰性。