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無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

閱讀:77          發(fā)布時(shí)間:2020-4-17
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無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒說明書

1、 試劑盒簡介

 流行性造血器官壞死病,是由無囊膜胞漿型虹彩病毒科蛙病毒屬的流行性造血器官壞死病毒

(EHNV)所引起的魚類疾病。病魚因肝臟、脾臟、腎臟造血組織和其他組織壞死而導(dǎo)致死亡。易感動(dòng)物主要為赤鱸、虹鱒等種類,其中,赤鱸對(duì)該病毒極為敏感,幼魚和成魚都可受 EHNV 感染。EHNV 屬于虹彩病毒科蛙病毒屬(除新加坡石斑魚虹彩病毒之外)病毒,本公司針對(duì)蛙病毒屬的流行性造血器官壞死病毒( epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)等病毒的主衣殼蛋白( MCP) 基因序列,開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確 、安全、操作簡單、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。

2、 試劑盒組成

無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑,具體組成參見表 1:

表 1:試劑盒組成(50test/盒)

試劑盒組成成分 體積

核酸提取試劑: 樣品 DNA 提取液 1

樣品 DNA 提取液 2 5ml×1 管

500µl×1 管

核酸擴(kuò)增試劑: DEPC 水

EHNV 熒光 PCR 反應(yīng)液

Taq 酶(5U/ul) 陰性對(duì)照

EHNV 熒光陽性對(duì)照 5ml×1 管

750µl×1 管

40µl×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

*保存條件:樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。

3、 樣本采集,存放及運(yùn)輸

樣本采集

采集活的或?yàn)l死的魚的腎或脾等組織,研磨PBS稀釋后提取核酸。或?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)分離病毒的有CPE 的細(xì)胞懸液提取核酸病毒。

存放

研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h;-70 ℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(多凍融 3 次)。

運(yùn)輸

采用冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

4、 檢測步驟

DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行):

取 n 個(gè) 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管,其中 n 為待檢樣品數(shù)、一管陽性對(duì)照和一管陰性對(duì)照之和, 對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。

每管加入 100 µl DNA 提取液 1,然后分別加入待測樣本、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照(陽性對(duì)照吸取前充分混勻)各 100µl,一份樣本換用一個(gè)吸頭;混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃~25℃條件下, 12 000 r/min 離心 10 min。

盡可能吸棄上清且不碰沉淀,再加入 10µl DNA 提取液 2,混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃~25℃ 條件下,2 000 r/min 離心 10 s。

100℃ 干浴或沸水浴 10 min;加入 90µl DEPC 水,12 000 r/min 離心 10 min,吸取上清, 即為提取的 DNA,冰上保存待用(提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存)。

熒光 PCR 檢測

無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行):

從試劑盒中取出熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶,2000×g 離心 5 秒鐘。每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2。

表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計(jì)

用量 14.5 μL 0.5μL 15μL

加樣(樣本處理區(qū)進(jìn)行):

向每個(gè)PCR 管中各分裝15μL 的混合液,再分別加入樣本DNA 模板10μL,蓋緊管蓋,500 r/min

離心 30 s。

熒光 PCR 檢測(在檢測區(qū)進(jìn)行): 循環(huán)條件設(shè)置:

一階段,94 oC /4 min;

第二階段,95oC/15 s,60 oC/60 s; 40個(gè)循環(huán);在每次循環(huán)的60 oC退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)檢測結(jié)束后,根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

5、無色桿菌屬通用PCR檢測試劑盒 結(jié)果判定

結(jié)果分析條件設(shè)定

直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整,以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的點(diǎn)為準(zhǔn)。

質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

5.2.1陰性對(duì)照無Ct值或無擴(kuò)增曲線。

5.2.2陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)<28.0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則,此次實(shí)驗(yàn)視為無效。

結(jié)果描述及判定

5.3.1陰性

無Ct值或無擴(kuò)增曲線,示樣品中無EHNV核酸。

5.3.2陽性

Ct值≤30,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,示樣品中存在EHNV核酸。為進(jìn)一步確診是EHNV,建議用普通PCR進(jìn)行確認(rèn)或測序。

5.4 有效原則

Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性,否則為陽性。

6、相關(guān)技術(shù)信息

MCP-153F: 5’-TCACCAAGCTGCCGTCTCT-3’ MCP-215R:5’-AAAACTGCTGCCCGAAAGC-3’

MCP-175T: (FAM)5’-CGCCAAGATGTCGGGCAACCC-3’(TAM

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